[发明专利]抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记Pi9caps及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记Pi9caps及其应用，属于农作物分子遗传育种学领域。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病是影响水稻产量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达10％～30％，严重时减产达40％～50％，甚至颗粒无收。实践证明，利用抗稻瘟病基因是控制稻瘟病害最经济、有效、环保的方法。到目前为止，在水稻中已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，已经克隆的有24个，它们分别是Pib,Pi-ta,Pi9,Piz-t,Pi2,Pid2,Pi36,Pi37,Rbr2,Pik-m,Pi5,Pid3,pi21,Pit,Pb1,Pish,Pik-p,Pik,Pia,Pi54,Pi25,Pi 1,Pi50,Pi54rh(国家水稻数据库中心http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。然而，尽管已经克隆的抗稻瘟病基因数量众多，但真正具有广谱抗性的却很少，在这些已克隆的抗稻瘟病基因中，来源于小粒野生稻的Pi9被多个研究组证实对收集自世界各地的稻瘟病菌均具有广谱抗性(Qu et.al.,2006；张国民等，2010；)，因此在水稻抗稻瘟病育种中，将Pi9基因导入到水稻骨干亲本材料中就显得尤为必要。

酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS)CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19-27bp)，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可参与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。

利用常规田间表型鉴定对抗稻瘟病基因的选择存在很大困难，选择效率很低，选择准确性很差，而利用抗稻瘟病基因连锁的分子标记或者是基因本身特异性标记选择，在生产上已经被证实是十分有效且经济的。针对Pi9基因的分子标记选择，研究者已经开发了一些标记，但它们都存在一些应用上的问题或者不便，如位于Pi9基因侧翼的此类分子标记由于和Pi9基因存在一定物理距离，在减数分裂过程中存在与Pi9基因发生交换的可能，从而使选择不够准确；针对Pi9基因本身的特异性分子标记目前有两例报道，一例是针对Pi9启动子区域的10bp插入/缺失位点(陈松彪等，2013)，另外一例是针对Pi9编码区18bp酶切片段差异的dCAPS标记(华丽霞等，2013)，但由于这两种标记差异的片段较小，通常需要非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳才能区分，因此在操作过程中有一些繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是更准确、快速的鉴定抗稻瘟病基因Pi9进而筛选以抗稻瘟病植株为亲本的后代植株。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸，根据水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的种类进行鉴定：如果待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T，则待测水稻为含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻和/或具有稻瘟病抗性的水稻，如果待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T，则待测水稻为不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻。

上述方法中，所述待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T具体可为A’或B’：