[发明专利]一种长白仔猪睾丸支持细胞永生系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种长白仔睾丸支持细胞永生系建立用培养液及使用培养液建立长白仔睾丸支持细胞永生系的方法和应用。

背景技术

睾丸支持细胞(sertoli cells，SCs)是位于睾丸组织生精小管内部一类具有强大分泌功能的细胞。它对生精细胞起到了支持和营养作用，有效的保证生精细胞的自我更新和精子发生的有序进行。

睾丸SCs不仅是构成生精细胞的支架，而且可以将血液中的各类营养物质间接地传送给各级生精细胞。同时自身也能分泌转铁蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维生长因子、胶质神经营养因子、干细胞分化因子、雄激素结合蛋白、硫酸糖蛋白1和2、转化生长因子α和β、白介素-1α和6等多种细胞因子，实现了生精细胞的自我更新和精子发生的有序进行。其中雄激素结合蛋白可以和雄激素相结合，在局部形成高浓度的雄激素环境时精子成熟的关键环节。

SCs在睾丸组织内还构成了血睾屏障，也参与免疫调控。不仅有效的防止生精细胞自身抗原与机体接触而引发的免疫反应。同时自身高表达FASL蛋白，可与激活后的T淋巴细胞上的FAS结合，促使T淋巴细胞凋亡，因此产生了睾丸组织的免疫豁免现象。

SCs不仅可以支持自体精原干细胞的增殖和分化，而且可以支持同种和异种的精原干细胞增殖和分化，还可促进睾丸外其他组织细胞的自我更新和分化。具有广泛的应用前景，但研究认为成熟的SCs是终末细胞，不能分裂。

猪源的睾丸传代细胞系(ST细胞系)，是早期通过传代方法建立的猪睾丸SCs的细胞系，不表达Large T和Egfp，适用于一些病毒的复制，已较多地应用于多种动物病毒学研究及疫苗生产中。所以能稳定表达Large T和Egfp的长白仔猪SCs建立对于猪业生产相关的试验研究也具有重要意义和潜在应用的前景。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种长白仔睾丸支持细胞永生系建立用的培养液、以及用该培养液建立长白仔睾丸支持细胞永生系的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种长白仔睾丸支持细胞永生系建立用的培养液，所述培养液为：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巯基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，45～55μg/mL维生素C和0.8～1.2％双抗的DMEM培养基。所述核苷酸为几种核苷酸的混合物。

在其中一个实施例中，所述培养液为：添加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，50μg/mL维生素C和含1％双抗的DMEM培养基。

本发明还提供了一种长白仔睾丸支持细胞永生系的建立方法，包括以下步骤：

1)、取长白仔猪睾丸组织，通过机械法和酶消化法获取高比例的长白仔猪睾丸支持细胞以后，完全培养基培养1～2h后更换新鲜培养液，继续培养，传代至获得细胞形态均一的F3代的睾丸成纤维细胞；

2)、利用携带Large T和Egfp基因的慢病毒液侵染F3代的睾丸成纤维细胞，进行细胞筛选，传代至得到稳定表达Egfp的细胞株；

3)将稳定表达Egfp的细胞株，进行单细胞筛选，筛选出表达睾丸支持细胞标记的细胞株，使用上述培养液传代50代以上，经细胞生物学分析检测，获得长白仔睾丸支持细胞永生系。

在其中一个实施例中，步骤2)中所述传代的代数为9代。

在其中一个实施例中，步骤3)中所述细胞生物学检测为生长曲线分析、特异性基因分析、细胞核型分析、特异性蛋白分析、致瘤性分析和ST细胞系对比。

本发明还提供了上述建立方法建立的长白仔睾丸支持细胞永生系。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：