[发明专利]提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用

说明书

一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用，由依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的H5N1流感NA‑HA‑M1基因与经酶切的pFastBac1载体连接，制得重组杆状病毒Bacmid质粒，并转染昆虫细胞得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达得到所述病毒样颗粒，其中，优化后的H5N1流感NA‑HA‑M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。具有生产成本低，产量高，免疫原性高，安全性好，便于大规模生产等优点，小鼠实验证明H5N1流感病毒样颗粒能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫，对现在主要流行的H5N1 2.3.2.1和2.3.4谱系的流感病毒具有很好的免疫和预防效果。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，微生物领域及生物制药领域，特别涉及一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用。

背景技术

A型流感病毒病毒感染能够引起呼吸道疾病对人类健康和世界经济造成严重影响，1997年第一次报道人感染高致病性H5N1(HPAI)流感病毒感染，据世界卫生组织报道截止到2014年1月9号全球共报道649人感染病例，并引起385人死亡，从2003年开始高致病性H5N1成为主要的人兽共患病之一并且不断的衍生出新的谱系，高致病H5N1主要在中国，越南，印度尼西亚，埃及，哥伦比亚和孟加拉国等地流行，其中2.3.2.1和2.3.4谱系成为主要的流行谱系，但是现在也很难预测不同的H5N1谱系中哪个会造成大规模的流行，因此现在急需发明一种疫苗能够交叉保护不同H5N1谱系的病毒。

现在主要通过鸡胚进行流感疫苗的大量生产，但是在流感大流行季节这种生产方式很难满足流感疫苗的大量生产，并且常常需要花费数月的时间来确定新的流感流行谱系，更重要的是最近在亚洲流行的H5N1流感病毒能够造出鸡胚的死亡。然而基于重组杆状病毒生产的流感病毒样颗粒能够解决H5N1流感疫苗生产中的问题，因此病毒样颗粒成为一种无生物安全风险，低成本，和高产出的流感疫苗生产方 式。流感病毒样颗粒具有和天然病毒相似的HA结构，因为其HA结构避免了常规灭活疫苗生产中的化学物质的破坏，从而能够产生更好的免疫保护作用。

目前流感病毒样颗粒包括由流感HA、NA和流感基质蛋白M1或者HA和M1在小鼠实验中能够产生真对流感高滴度的特异性抗体，这些颗粒能够展示出很好的针对异源流感病毒的保护活性，但是还没有文献报道与灭活的全病毒疫苗相比流感病毒真对不同H5N1谱系的保护活性。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒及其方法和应用。本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产包含流感NA-HA-M1的H5N1流感病毒样颗粒，并且在小鼠体内研究在弗式佐剂时与灭活的流感疫苗相比针对不同谱系的流感的病毒的保护活性。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒，由依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与经酶切的pFastBac1载体连接，制得重组杆状病毒Bacmid质粒，并转染昆虫细胞得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达得到所述病毒样颗粒，其中，优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述优化后的H5N1流感NA-HA-M1基因与pFastBac1载体酶切的限制性内切酶为Not I和Sph I。

进一步的，所述优化遵循：编码的氨基酸序列不变；将稀有密码子去除；将影响mRNA稳定性和核糖体结合的茎环结构破坏。

进一步的，所述病毒样颗粒的纯化方式为，在4℃离心机中用2,000rpm离心20min去掉细胞碎片，用30,000rpm离心60分钟进行浓缩，用PBS溶解沉淀过夜后经20％-30％-60％的蔗糖30,000rpm离心1小时进行纯化。

上述提供流感病毒异源保护的病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：