[发明专利]基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及基于纳米金模拟过氧化物酶催化显色体系的脲酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术

脲酶（urease）是一种含镍的寡聚酶，它能高效、特异性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。医学上，细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素，它可诱发许多疾病，如肾盂肾炎、肝昏迷、消化性溃疡和感染性尿路结石等。脲酶抑制剂作为一种药物可溶解尿结石，阻止尿液生成新的晶体。农业上，当土壤脲酶的活性过高时，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大气中，造成经济损失及环境污染。为了减少环境污染和提高化肥中尿素氮的利用率，脲酶抑制剂的使用是一个极佳的选择。由上可知，脲酶及其抑制剂的检测具有十分重要的意义。

随着纳米技术的发展，许多种类的纳米材料，例如，金属纳米材料、氧化物纳米材料、半导体纳米材料和导电纳米聚合物等已经广泛被应用于化学及生物传感器领域。在所有的纳米材料中，金纳米粒子（Gold nanoparticles, GNPs）由于其易于制备和生物功能化、优良的生物稳定性和独特的光谱特性最受到研究者们的关注。基于纳米金的色度传感器近年来得到了广泛关注，其中的大部分均是基于纳米金聚集或聚集再分散过程中的等离子体耦合而产生的颜色变化。纳米金已越来越多地应用于比色法检测细胞、蛋白质、DNA、金属离子和小分子等。

本发明利用纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色体系与脲酶催化尿素水解反应体系耦合，构建了一种简便、灵敏的脲酶及其抑制剂的检测新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色体系的脲酶及其抑制剂的测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用脲酶催化尿素水解反应体系耦合纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色反应体系，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于脲酶及其抑制剂含量的测定。

上述所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

本发明所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶测定方法，其特征是将0.05 mL不同浓度的脲酶溶液和尿素溶液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL 质量分数为30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，在1.8 ~ 90 U/L浓度范围内，A₄₅₀与脲酶浓度呈线性关系，检测限为1.8 U/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

所使用的尿素溶液的体积为0.1 mL，浓度为0.5 moL/L。