[发明专利]一种产糖醇酵母菌株基因组重排技术的构建及其应用

说明书

一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术主要包括基于显色法的产糖醇菌株高通量筛选和基于双荧光染色的融合细胞高效流式分选。该技术可以实现产糖醇酵母的高效基因组重排与筛选，具有简便，低成本，高效，实用等特点。应用该技术成功实现了对天然产糖醇异常毕赤酵母高效快速地改造，糖醇产量提高34%以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种产糖醇酵母菌株基因组重排技术和该技术在产糖醇异常毕赤酵母(Pichia anomala)基因组改造中的应用。

背景技术

糖醇是指糖类的醛、酮羰基被还原为羟基后生成的多元醇，通式H(CHOH)_n+1H，由于加氢作用而失去了还原性，每个碳原子上会连有一个羟基。它们具有很多独特的性质，例如在机体内的代谢能量较低，可防治牙齿龋变，与低胰岛素代谢响应，因此，是一类重要的功能性食品原料。此外，糖醇在医药领域，化工领域以及动物营养等方面也具有更多的应用。在医药领域，它们是药物合成的重要中间体，广泛用于阿糖胞苷、阿拉阿糖腺苷、D-核糖、L-核糖、去氧核糖、L-阿拉伯糖等的合成原料。如D-阿拉伯糖醇的衍生物1，4-二脱氧-1， 4-亚胺基-D-阿拉伯糖醇是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，可防治艾滋病。糖醇还可以作为运输介质，以通过血脑屏障。另外，在化工方面，可以有机合成制取醇酸树脂和表面活性剂，糖醇是高分子发泡材料合成的激活剂，可用做显影材料的稳定剂，还可增强铝电容器在高温下的可靠性以及提高电解质溶液的黏度等。因而，糖醇作为一类高附加值产品已广泛应用于食品、医药、化工、皮革、涂料以及国防等行业。其中，D-阿拉伯糖醇与木糖醇是研究较多的一类多功能五碳糖醇，2004年被美国能源部(DOE)列为12类高附加值生物基化学品之一。

目前糖醇的主要生产方法有：自然提取法、化学合成法及生物合成法。糖醇广泛存在于自然界植物中，但含量很少，提取困难，直接提取不经济。化学合成法在高温高压条件下催化加氢得到糖醇，该方法过程较复杂、设备投资大、安全要求高、操作费用高、污染较严重、底物要求高等。生物合成方法具有安全、高效、绿色等潜在优势，其反应条件温和，并显示出严格的对映选择性或区域选择性，还避免了化学合成法所需高温高压反应条件和昂贵的催化剂，节省能源消耗。作为一种重要催化载体，微生物在化学品生物合成中的应用越来越广泛。糖醇生物合成主要是利用产糖醇的微生物发酵或转化葡萄糖、木糖以及木糖母液等生物质原料，关于微生物制造多功能糖醇的研究已经广泛开展，主要包括产糖醇代谢工程菌株的构建以及天然产糖醇微生物的筛选与改造。随着生物技术的不断发展与成熟，微生物发酵工业得到快速发展，其中工业菌种性能的改良是重要推动力。然而，工业菌株的高产、高耐性等优良特性是由大量基因共同决定的，而大多数工业微生物菌株改良所面临的问题。虽然理化诱变等传统育种手段在工业微生物菌种改良中发挥了重要作用，但它们需要与现代育种手段相结合才能发挥更高的育种工作效率。

基因组改组技术(Genome shuffling)是一种典型的全面组合技术手段，是全基因组代谢工程的延伸，可以快速、高效地筛选出优良菌株，作为的重要基因组工程技术在进化工程得到广泛的应用。Stemmer等提出了全基因组改组技术，它是一种建立在传统诱变育种、细胞融合与高通量筛选基础之上的体内分子育种新技术，使诱变过程中产生的丰富的基因组(多种突变表型)，由原生质体融合而发生大片段改组。随后，经过选择，使多种正向突变在融合菌株中积累，加速获得目的性状的突变菌株，消除传统诱变步步积累的繁琐、低效以及积累大量有害突变的缺点。

发明内容

本发明属生物技术领域，构建了一种高效的产糖醇酵母基因组重排技术，并成功应用于产糖醇酵母的菌种改造，提高了重组与筛选效率。