[发明专利]一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法

权利要求书

1.一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式的建立方法，其特征在于：该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼；

包括以下步骤：

⑴利用Ensemble在线数据库，查找斑马鱼EDA基因序列no：ENSDARG00000074591并下载，在该序列查找PAM序列即5’-GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’，在EDA基因外显子找到的靶向作用序列为TTAGGCAAGAAAGGGCCCCC【TGG】，并设计突变检测引物F-eda:ttgttttgcttctcatcagttg和突变检测引物R-eda: tttgctctgctgcttcactc；

⑵目标序列的野生型等位基因的测序验证：

随机选取5枚24hpf野生型斑马鱼胚胎，提取基因组DNA模板，然后用F-eda和R-eda进行PCR扩增，得到片段长度为358bp 的PCR扩增产物Ⅰ，该PCR扩增产物Ⅰ以所述突变检测引物F-eda直接测序，以表明目标基因组序列和数据库中的序列一致，无SNP应用重叠；

⑶构建sgRNA：

⑷建立eda-sgRNA模板：

以PCR法获得sgRNA的体外转录的模板，该模板序列如下： TAATACGACT CACTATAGTT AGGCAAGAAA GGGCCCCCgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaacttgaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt t；

⑸sgRNA体外转录：

以所述PCR扩增产物Ⅰ为模板，用T7 RNA聚合酶进行sgRNA体外转录，得到sgRNA；所述sgRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为1000ng/ul；

⑹Cas9 mRNA体外转录：

以U7驱动的人源化的Cas9编码序列为模板，用U7 RNA聚合酶进行Cas9体外转录，然后戴帽并加尾，得到Cas9 mRNA；所述Cas9 mRNA经无水乙醇法沉淀后使其浓度为600ng/ul；

⑺斑马鱼受精卵的显微注射及突变检测：

将所述sgRNA与所述Cas9 mRNA等量混合后，显微注入到1~2细胞期的野生型斑马鱼受精卵，待胚胎发育至24 hpf时，取5枚胚胎，制备基因组DNA模板，然后以所述突变检测引物F-eda和所述突变检测引物R-eda进行PCR扩增，得到PCR扩增产物Ⅱ；将所述PCR扩增产物Ⅱ亚克隆到pEASY-T3载体中；并以T7和Sp6通用引物对转化子进行扩增，将PCR产物十个一组共两组直接送测序，测序引物为T7或Sp6其中一条；

⑻突变体鳞片发育观察及染色鉴定：

对检测有EDA 基因突变的斑马鱼的鳞片发育情况进行显微观察，筛选获得EDA基因外显子4靶位点引入插入突变导致鳞片缺失突变体，对鳞片发育异常个体进行鳞片染色鉴定，以确定鳞片是否有发育缺陷。

2.如权利要求1所述方法建立的一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式的应用，其特征在于：该鳞片缺失斑马鱼模式应用于皮肤附件相关基因功能的验证及外胚层发育不良药物的筛选。