[发明专利]一种鲑肾杆菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检测领域，具体而言，涉及一种鲑肾杆菌的检测方法。

背景技术

鲑肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)是肾杆菌属的唯一成员，是一种细胞内寄生菌。其具有以下形态：规则短杆菌，0.3～1.0μm×1.0～1.5μm。成对，有时成短链。细胞呈革兰氏阳性，没有荚膜，不运动，不生孢，好氧。

鲑肾杆菌广泛分布在大量养殖鲑科鱼类及出产鲑科鱼类的国家和地区，如加拿大、智利、英国、法国、德国、冰岛、意大利、日本、西班牙、美国和南斯拉夫等。在鱼类养殖产业中，为了了解养殖鱼的生长状态，常需要对其进行不定期的定性检测。

在相关技术中，该菌常见的检测方法为将供试样品在增菌培养基上培养预定时间，然后通过观察菌落形态、生化鉴定以判定供试样品中是否含有该菌。

然而由于鲑肾杆菌的生长条件苛刻，生长速度缓慢，而且后续分离培养的技术难度很大，进而造成这种常规方法的检测结果不可信，存在准确度低的缺陷。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲑肾杆菌的检测方法，该检测方法具有。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种鲑肾杆菌的检测方法，包括以下步骤：

1)、取待检样品，并进行预处理；

2)、对预处理后的样品进行细菌核酸提取，以提取到的核酸为模板，以P3和M21为引物进行PCR扩增；

3)、以步骤2)得到的扩增片段为模板，以P4和M38为引物进行PCR扩增；

4)、将步骤2)和步骤3)得到的扩增片段分别进行琼脂糖凝胶电泳、回收以及测序后分别与如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行同源性比对分析；

其中，P3、M21、P4和M38的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

本发明提供的这种鲑肾杆菌的检测方法，其实现了鲑肾杆菌的分子检测，具体的，以特定的引物P3和M21对从待检样品中提取的核酸进行初步扩增；若待检样品中含有鲑肾杆菌，则经过PCR扩增的产物中含有鲑肾杆菌P57表面蛋白基因DNA片段(可经过电泳初步检测)。

为了防止单一的PCR扩增易出现假阳性的结果，对第一次扩增后的片段以P4和M38为引物再次进行PCR扩增；并将得到的产物进行电泳(若出现相应的特异性条带，则说明该样品中含有鲑肾杆菌)。进一步的，为了确保使得检测结果的准确性；分别对两次PCR扩增后的片段电泳检测后进行测序；并将其分别与鲑肾杆菌P57表面蛋白基因383bp的DNA片段序列(SEQ ID NO：1)、鲑肾杆菌P57表面蛋白基因320bp的DNA片段序列(SEQ ID NO：2)进行同源性比对分析，通过判定待检样品中是否含有鲑肾杆菌P57表面蛋白基因，并结合两次PCR的电泳结果可准确的获知该待检样品中是否含有鲑肾杆菌。

可选的，在步骤1)中：

所述预处理包括将待检样品研磨后并加入血清体积百分含量为8-12％的199细胞培养液。

可选的，在步骤1)中：

所述待检样品取自待检个体的肝或肾。

可选的，在步骤2)中：

所述PCR扩增的反应体系为：模板8-12μl，10Mm的dNTP1-3μl、100pmol/μl的P32-3μl，100pmol/μl的M212-3μl，25mM的MgCl₂9-11μl，10×PCR buffer 8-12μl，5U/μl的Taq酶1μl，DEPC水补齐至100μl。

可选的，在步骤2)中：

所述PCR扩增的反应的程序为：94℃预变性4-5min；94℃变性28-32s，60℃退火28-32s，72℃延伸60-70s，共30-35个循环：

可选的，在步骤3)中：

所述PCR扩增的反应体系为：模板4-6μl，10Mm的dNTP1-3μl、100pmol/μl的P42-3μl，100pmol/μl的M382-3μl，25mM的MgCl₂9-11μl，10×PCR buffer 8-12μl，5U/μl的Taq酶1μl，DEPC水补齐至100μl。

可选的，在步骤3)中：