[发明专利]检测细胞外基质MMP13的BRET探针、基因、表达载体和构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测细胞外基质MMP13的BRET探针、基因、表达载体和构建方法。

背景技术

基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMPs)是一组依赖Zn2+依赖的细胞外酶，广泛存在于各结缔组织中，在细胞外基质的降解中起重要作用。其中，MMP13又称为胶原酶-3，它是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中重要的降解酶，能够特异性地降解胶原分子中三维螺旋结构的酶，其对于H型胶原的降解效率是所有基质蛋白酶中最高的。

MMP13主要由滑膜细胞、软骨细胞、中性粒细胞等产生，主要通过破坏H型胶原之间的肽链而达到裂解软骨的目的，因此在软骨中MMP13表达水平升高是导致骨关节炎(OA)节软骨退变的主要因素之一。并且进一步在反复的验证之后，骨关节炎患者中MMP13蛋白比正常人高十倍，且表达量随着骨性关节炎的进展而逐渐增加，MMP13逐渐成为OA诊断和治疗的一项生理性指标，并且可能为OA的治疗提供一个新的靶点。

而现有的MMP13的检测方法，最常用的是双抗体夹心法测定，受限于抗体的特异结合性以及检测灵敏度的限制，且操作步骤过程繁琐，并且无法检测到活性MMP13的含量；并且检测的过程中都需要损伤细胞，不适用于活体的蛋白酶的实时动态监测。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够在真核细胞膜表面表达的用于检测细胞外基质MMP13的BRET探针、基因、表达载体和构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种检测细胞外基质MMP13的BRET探针，包括BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白，所述BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白之间通过MMP13特异性识别降解的多肽底物连接；

其中，所述BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的Rluc8蛋白，所述BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。

本发明构建的上述探针，探针自身的供体和受体荧光蛋白之间通过一可被MMP13特异性识别降解多肽底物连接产生BRET，当多肽底物被MMP13特异性识别降解之后，BRET现象消失，只能检测到供体蛋白底物发出的发射光产生荧光信号变化，从而实现检测目的；并且Rluc8蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子受体(PDGFR)的跨膜区域，因此能锚定在细胞膜的表面，从而可以在不损伤细胞的情况下进行活体检测，同时还具有更高的灵敏度。

本发明进一步还提出编码上述检测细胞外基质MMP13的BRET探针的基因，以及该编码基因在真核细胞内进行表达的表达载体；其中，

编码基因包括顺次连接的BRET生物发光供体编码基因、MMP13特异性识别降解的多肽底物编码基因和BRET受体荧光蛋白编码基因；所述BRET生物发光供体编码基因为具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的Rluc8蛋白编码基因。

针对本发明中真核表达载体的实施，本发明进一步还提出上述表达载体的构建方法，包括如下步骤：

将具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列的Rluc8蛋白编码基因克隆至质粒pDisplay的多克隆位点，得到Rluc8表达质粒；

将黄色荧光蛋白的编码基因克隆至所述Rluc8表达质粒中与Rluc8蛋白编码基因末端衔接，形成荧光融合体表达质粒；

将具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的多肽底物编码基因插入至所述融合体表达质粒中Rluc8蛋白编码基因和黄色荧光蛋白的编码基因之间。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例用于检测细胞外基质的MMP13的BRET探针示意图；

图2为图1的BRET探针中多肽底物被MMP13特异性识别降解BRET小时示意图；

图3为本发明实施例质粒pDisplay克隆Rluc8蛋白编码基因后的质粒图谱；

图4为图3中质粒进一步克隆黄色荧光蛋白编码基因后的质粒图谱；

图5为图4中质粒进一步插入多肽底物编码基因后的质粒图谱；

图6为激光共聚焦显微镜下的细胞膜表面、单独的BRET探针和BRET探针结合表达定位于细胞膜上的荧光对照图；