[发明专利]Platyamoeba thermophila生产耐热超氧化物歧化酶（SOD）的方法

说明书

技术领域

利用Platyamoeba thermophila生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工程技术领域。本发明涉及利用菌株Platyamoeba thermophila保藏号为ATCC 50600，通过液态发酵获得耐高温SOD。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能够增强机体抗辐射损伤的能力。近年来，它已经成为治疗炎症、肿瘤和自身免疫疾病的新型抗炎药物；化妆品和食品行业中用于防晒、防皮肤衰老和抗炎的添加剂以及用于某些疾病探针的生化试剂。SOD广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。当前，SOD主要从动物血液(如猪血或者牛血)中提取(袁烨.超氧化物歧化酶的制备方法[P].申请号,02147888.0,2002-12-19；徐文中,阎家麒.超氧化物歧化酶大规模生产新工艺[P].申请号,01144922.5,2001-12-24)，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响。由于动物、植物特别是动物血液来源困难，而微生物可以人工培养，有利于实现工业化生产。根据目前报道，已经可以通过微生物发酵法生产SOD，但主要为胞内酶(刁治民,姚银霞，张文静.酵母菌SOD发酵条件的研究[J].青海师范大学学报(自然科学版)，2002,4:48-51；杨明琰,郭爱莲,沈俭,等.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵条件研究[J].食品科学,2005,26(10):147-150)，提取工艺较为繁琐。

天然SOD热稳定性较差，在加工和使用过程中容易受热失活。如何有效地解决SOD在高温工艺条件下酶活力的稳定问题，如何使含SOD的产品在生产工艺流程中不用顾忌高温是高效利用SOD的关键。利用生物工程生产新一代高稳定性、高耐热性的SOD是当前SOD开发最重要的途径。

本发明采用Platyamoeba thermophila生产SOD，Platyamoeba thermophila是一种耐热菌,可以产生耐高温的SOD,采用该菌发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能耐高温，开发前景广阔。

发明内容

目前能够产生SOD的菌株比较少，主要为一些酵母，且为胞内酶，需要破壁后才能提取分离，操作成本高，不利于大规模生产制备。本发明的目的是针对当前问题，利用菌株Platyamoeba thermophila保藏号为ATCC 50600，通过液态发酵获得胞外耐热SOD。

本发明的技术方案如下：液态发酵培养基组成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l，K₂HPO₄1-4g/l,MgSO₄7H₂00.1-0.5g/l，NaCl 1-2g/l。在一定体积的发酵罐内装入发酵体积60-70％(v/v)的培养基，灭菌冷却后接入Platyamoeba thermophila，接种量为1-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为20-60℃，发酵周期为2-6天。最终发酵液中SOD活力最高可达3000U/ml。

本发明所有种子培养基配方与发酵培养基相同。将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶后，种子的培养时间为48小时，种子的培养温度为45℃。

菌种保存用斜面培养基配方为：葡萄糖20g/l，MgSO₄7H₂00.2g/l，酵母膏g/l，琼脂20g/l，pH自然。

SOD活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用。SOD活力测定方法和SOD活力定义详见：Chin-Wen Lin,Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，The extraction and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-Wen Lin,Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997，46(3):303-312.

本发明有如下特征：