[发明专利]一种构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法及通过该法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤生物学领域，具体涉及一种反应氧族单机制造模构建体外肿瘤多药耐药细胞模型的方法，同时还涉及通过该法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株。

背景技术

构建体外肿瘤细胞模型是研究肿瘤发生、发展及干预的重要实验基础，造模条件和造模方法的选择是模型构建的决定因素，是揭示同类肿瘤形成的分子机制及研究肿瘤药物干预的关键平台。

肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞接触抗肿瘤药后产生抗药性，也对结构不同、机制各异的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象。MDR是临床肿瘤化疗最常见的问题，至今未能解决，其原因或与其核心机制不明、无法进行靶向预防及治疗有关。因此，开发多药耐药肿瘤的细胞模型对于进一步研究其发生机制、探索其治疗靶点及筛选、评价相关药物具有重大意义。然而MDR产生的核心机制尚未阐明，研究表明：外排蛋白的表达及功能上调、细胞解毒系统活力增强、抗肿瘤靶点改变以及凋亡应答失敏等因素相互联系、互相影响，既是MDR细胞的表型特征，又介导了MDR的形成。因此，寻找连接和主导以上各机制的核心因素，并利用该因素设计、构建MDR细胞模型，不仅有助于阐明MDR的病理过程，更将为相应靶点探索、药物筛选提供更为合理、高效的评价对象。

由于核心机制不明，国内外构建MDR肿瘤细胞模型的主流方法是：直接选用临床使用的某种抗肿瘤药物，对化疗敏感的一种肿瘤细胞长期培养，得到该细胞对某抗肿瘤药的耐药细胞株。该方法所构建的MDR细胞模型是当今研究MDR相关领域的主要工具。此类细胞株的构建主要包括以下几种类型：药物浓度递增法、大剂量冲击法、大剂量冲击结合浓度递增法及转基因结合药物筛选法等。这种构建方式可以在一定程度上模拟临床MDR产生的基本情况，却仍有多方面不足，包括：(1)模型设计难以模拟临床MDR形成的核心机制：临床抗肿瘤治疗往往使用药物联用，因此，仅选择一种药物建立的MDR模型，其特征虽然可能具备某些临床MDR的共性，但更会体现该种药物药理作用相关的一系列个性，得到的耐药细胞株恶性表型具有明显的局限性，因此以该模型为实验对象进行的机制、靶点及药物研究无法代表其他情况MDR的普遍情况、甚至会忽视多药耐药形成的核心因素，无法满足科研需求。(2)实验操作相关的缺点：传统构建方法操作繁琐、复杂，培养成本高，构建时间普遍较长，相应失败率较高，培养条件没有统一标准，所得细胞耐药程度差异大。(3)实用性方面的限制：MDR细胞模型是研究肿瘤多药耐药机制及药物的常用、必要平台，然而传统模型建立的种类非常有限，市售常用的MDR细胞株种类少、价格高，无法满足个体化研究需要。其次，由于每次建模只能得到一种药物诱导的一种细胞株，且所得模型仅对该种药物有较高的耐药性，而对其他药物耐药程度有限，因此，以其为实验对象所得的结果将与临床MDR情况出现较大偏差。此外，抗肿瘤药物诱导建立的耐药细胞株生长速度普遍较慢，也大大限制了研究使用。综上所述，寻找耐药形成的共性、核心机制，探索更有优势的MDR模型培养方式，将有助于改善本领域的研究平台，促进相关基础研究及药物研究的发展。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种以反应氧族(reactive oxygen species，ROS)为单一诱导因素构建体外肿瘤多药耐药细胞模型的方法，同时还涉及依据该法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ROS。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：一种构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，包括以ROS为孵育药物对敏感肿瘤细胞进行持续培养、使敏感肿瘤细胞产生多药耐药的步骤。

所述ROS为H₂O₂。

所述敏感肿瘤细胞为人乳腺癌细胞MCF-7。

所述方法的具体步骤是：

(1)细胞培养：选择某种对化疗药物敏感的肿瘤细胞株，调整细胞浓度，分组培养备用；

(2)筛选培养条件：各组细胞分别使用不同的ROS浓度进行持续培养，4周后在存活细胞组中选择最高的ROS浓度作为该种耐药模型的最优造模浓度；

(3)构建耐药模型：选用对数生长期的该种肿瘤细胞，调整细胞浓度，使用步骤(2)所得的最优造模浓度持续培养肿瘤细胞，培养过程中按生长情况传代；

(4)耐药性跟踪指导的循环培养：每隔2-3周对步骤(3)中的ROS培养细胞进行耐药倍数评价；重复执行步骤(3)的相关操作，直到评价结果提示细胞产生的耐药性符合预期；冻存细胞。