[发明专利]一种酵母表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种酵母表达载体。

背景技术

酿酒酵母表达载体是基因工程中常用的载体，目前商用载体主要是Invitrogen公司的pYES系列、pYC系列和ATCC的YEP系列、pBT系列等，其中，pYES2作为酿酒酵母表达系统的表达载体应用较为广泛，尤其在基因功能验证中具有广泛的应用：王留强等（2011）通过把二色补血草的DREB基因构建到 pYES2中，验证了该基因在干旱、高盐和冷害胁迫下的抗性，以及抗其他重金属的能力；周凯（2011）把棉花GhGnT基因构建到pYES2上，发现其过表达能提高酵母耐盐性；孙新华等(2012)则用pYES2载体验证了四翅滨黎AcERF基因对高温、强碱和活性氧的抗性。然而这些商用载体均为细胞内表达载体，不适于细胞外分泌表达。赵颖怡等（2002）将来源于克鲁维酵母的菊粉酶基因是信号肽克隆至pYES2载体上，构建了一种酿酒酵母分泌表达载体；胡亚冬等（2009）将酿酒酵母的a-交配因子克隆至酿酒酵母胞内表达载体pYES2/CT中，构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/a-factor，实现了酵母系统分泌蛋白的外表达。

然而，当目的基因构建到表达载体pYES2上时，尽管在添加诱导剂诱导之后，仍然需要通过诸如SDS-PAGE和Western杂交等方式来确认目的蛋白是否表达以及表达量，为了快速检测目的基因是否在酵母细胞中有效表达，Biovector有限公司将绿色荧光蛋白基因（EGFP）引入表达载体中，构建pYES2-EGFP表达载体（如图1所示），目的基因与绿色荧光蛋白基因同时表达，通过荧光检测即可获得目的基因表达量，但是该表达载体仅有BamHI一个酶切位点可用，这样对目的基因的克隆以及含有该酶切位点基因酵母转化造成了限制，不能广泛应用于基因工程中。

pJITI66-GFP瞬时表达载体是由南京农业大学作物遗传与育种国家重点实验室改造而成，已经在多篇文章中报道（如“棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立”李妮娜等，作物学报，2014；“葡萄花发育基因的亚细胞定位和表达分析”杨光等，中国农业科学，2011），载体所含GFP基因为增强型荧光蛋白基因；目前，含有该蛋白基因且具有多个酶切位点的酵母表达载体未见报道。

发明内容

   针对上述问题，发明提供一种酵母表达载体pYES2-GFP，较现有载体，引入HindIII和SalI酶切位点，便于多目标基因的克隆，本发明是这样实现的：

   一种酵母表达载体，该载体是利用HindIII和EcoRI对瞬时表达载体pJITI66-GFP和载体pYES2分别进行双酶切，回收酶切目的片段HindIII-GFP+NOS-EcoRI和HindIII-pYES2-EcoRI中，再以T4DNA连接酶连接后获得；所述酵母表达载体包含HindIII、SalI和BamHI的酶切位点以及NOS终止子。

  由本发明方法获得的酵母表达载体pYES2-GFP。

   本发明所构建的pYES2-GFP酵母表达载体采用GALI启动子，可用的多克隆位点内切酶分别为HindIII、SalI和BamHI,相比市售pYES2-EGFP表达载体，引入了SalI和HindIII两个新的酶切位点，基因选择的酶切位点范围扩大，便于基因的功能鉴定和克隆；同时添加了NOS终止子，便于融合蛋白翻译的有效终结；当目标基因与GFP基因融合时，快速检测GFP的表达，即可推断目标蛋白表达与否，荧光信号强，目标蛋白亚细胞定位准确，省去了诸如SDA-PAGE和Western杂交等蛋白检测手段，操作简单，结果可靠，对于目标基因在酵母细胞中的快速表达检测和目标蛋白的细胞定位具有重要的意义。

附图说明

图1为市售pYES2-EGFP表达载体结构示意图。

图2为实施例表达载体构建流程示意图。

图3为实施例pYES2-GFP表达载体结构示意图。

图4为实施例HindIII-GFP+NOS-EcoRI电泳图。

图5为实施例HindIII-pYES2-EcoRI电泳图。

图6为实施例pYES2-GFP电泳图。

图7为细胞膜蛋白TIP5;1在酵母细胞中的表达及耐旱功能结果示意图。

图8为细胞膜蛋白TIP5;1在拟南芥原生质体中的亚细胞定位分析结果示意图。

图9为细胞膜蛋白蛋白SIP1；3在酵母细胞中的表达结果示意图。