[发明专利]一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法

权利要求书

1.一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，包括以下步骤：

步骤1、胎盘的采集及运输；

步骤2、剔除胎盘的羊膜和蜕膜得到胎盘小叶；

步骤3、将胎盘小叶剪切至1mm³的组织块，加入注射用水裂解红细胞并清洗；

步骤4、使用Ⅰ型胶原酶消化得到细胞外基质蛋白和组织块组成的糊状混合物；

步骤5、取上述糊状混合物涂抹在培养皿内晾干固定；

步骤6、向上述培养皿内加入无血清培养体系进行原代培养并全量换液；

步骤7、待胎盘间充质干细胞融合率达到标准时，使用细胞消化液消化收集原代细胞并进行传代；

步骤8、对胎盘间充质干细胞进行细胞生物学鉴定；

步骤9、收集第三代胎盘间充质干细胞接种于Transwell共培养系统的下室；

步骤10、采集脐血后使用分离液对脐血单个核细胞进行提取；

步骤11、收集的脐血单个核细胞接种于Transwell的上室，添加无血清培养体系培养；除去悬浮细胞并进行首次全量换液，与下室的胎盘间充质干细胞在低氧环境下共培养，收集上室的原代细胞进行传代扩增；

步骤12、对扩增的脐血间充质干细胞进行细胞生物学鉴定。

2.如权利要求1所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤3中注射用水裂解红细胞的时间为1-5min。

3.如权利要求2所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤3中注射用水裂解红细胞的时间为2min。

4.如权利要求1所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤4中Ⅰ型胶原酶短时消化时间为5-20min。

5.如权利要求4所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤4中Ⅰ型胶原酶短时消化时间为10min。

6.如权利要求1所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤6中无血清培养体系为无血清培养液，并添加5%的无血清添加剂、0.4mmol/L α-酮戊二酸、20ng/mL的层粘连蛋白-5、0.05mg/L的谷胱甘肽。

7.如权利要求1所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤6中的胎盘间充质干细胞原代培养首次全量换液时间为培养24h。

8.如权利要求7所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤11中的脐血间充质干细胞原代培养首次全量换液时间为培养24h。

9.如权利要求8所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤11中的低氧条件为氧气10%、二氧化碳5%、氮气85%。

10.如权利要求9所述的利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法，其特征在于，所述步骤11中的收集上室的原代细胞进行扩增时的标准是融合率达到60%。