[发明专利]一种用于检测LEPR基因127bpdeletion可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以待测cDNA为模板，以引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR扩增ACTB内参基因，以引物对P为引物，实时荧光定量PCR扩增LEPR基因127bp deletion可变剪接体，所述的荧光定量PCR扩增的反应体系由2×SYBR^®Premix Ex Taq^TMⅡ 9~11μL，去RNA酶的超纯水7~8μL，引物P-F或ACTB-F0.5~1μL，引物P-R或ACTB-R0.5~1μL和cDNA模板0.5~1.5μL构成，其反应方法是92~96℃预变性4~6min，92~96℃变性8~12s，55~65℃退火25~35 s，70~74℃延伸25~35s，35~45个循环；

所述的引物是针对LEPR基因mRNA水平127bp缺失后的部分第9外显子和第10外显子连接处的序列-CTTGTGAACGATCGCATGTG-设计识别该可变剪接体的特异性引物P-F；在第10外显子上设计该可变剪接体的引物P-R，引物对P只能扩增有127bp缺失的剪接体，从而避开其他已知或未知LEPR基因可变剪接体的干扰；

所述的引物对P为：

上游引物，P-F：5’- CTTGTGAACGATCGCATGTG -3’；

下游引物，P-R：5’- GTGGTATCTTAACTGCAAGG -3’；

所述的引物对ACTB为：

上游引物，ACTB-F：5’- GAGAGAAGATGACACAGAC -3’；

下游引物，ACTB-R：5’- GTCCATCACAATACCAGTGG -3’；

（2）对步骤（1）的荧光定量PCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用 2^-△CT相对定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。

2.根据权利要求1所述的检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的方法，其特征在于，所述的反应体系由2×SYBR^®Premix Ex Taq^TMⅡ 10.0μL，去RNA酶的超纯水7.4μL，引物P-F或ACTB-F0.8μL，引物P-R或ACTB-R0.8μL和cDNA模板1.0μL构成，其反应方法是94℃预变性5min，94℃变性10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30s，40个循环。

3.根据权利要求1所述的检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的方法，其特征在于，所述步骤（1）中引物对ACTB的扩增产物长度为116bp，引物对P的扩增产物长度为131bp。

4.根据权利要求1所述的检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的方法，其特征在于，

所述步骤（2）中采用相对定量方法计算该剪接体的相对表达量=2^-△CT =2^{-(CTLEPR-CTACTB)}，为方便比较结果均乘以1000；所述的SPSS version 20.0软件差异显著性检验，采用单因素方差分析，P≤0.01表示差异极显著，所有结果均以平均值和标准差来表示。