[发明专利]一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。目前已知对心肌梗死、糖尿病、骨质疏松、骨坏死、狼疮性肾炎、肝硬化、肝衰竭、多发性肝硬化症、系统性红斑狼疮、帕金森病、脊髓损伤等都有一定治疗效果。

早期的间充质干细胞主要来源于成人骨髓，但成人骨髓间充质干细胞数量及增殖分化潜能会随供体年龄的增加而下降，病毒感染率较高，且采集具有创伤，供体所受痛苦较大，使其来源受限。而从脐血和外周血中培养间充质干细胞也具有一定难度：由于间充质干细胞在脐血或动员的外周血中数量较少，其体外扩增培养的方法目前只处于实验室研究阶段。当临床需要应用一定数量的干细胞治疗时，需同时考虑干细胞种类及干细胞增殖能力，这就限制了骨髓和脐血干细胞的应用范围。

近来有学者从分娩后的废弃物-脐带中分离培养出间充质干细胞，并进行了形态学、分化功能和表面标志物等生物学表型鉴定，确定了这种新型间充质干细胞的开发潜质。这种新型间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比具有明显的优势：（1）来源充足，取材方便，无伦理学争议；（2）含量丰富，可在体外进行分离、培养，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能；（3）免疫原性极低；（4）分泌能力强，在增殖生长过程中会产生大量生物活性因子等。

目前，从脐带中获得的间充质干细胞除应用于临床研究与治疗外，干细胞分泌产生的各种多肽类细胞因子在美容保健领域也越来越被关注。在干细胞的培养液中含有多种干细胞分泌的生物活性蛋白，如干细胞因子（SCF）、肝细胞生长因子（HGF）、神经生长因子（NGF)、基质细胞源性生长因子（SDF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因（IGF）、表皮生长因子（EGF）、白细胞介素（IL）、巨核细胞集落刺激因子（M-CSF）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）等，通过多种因子的协同作用可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。美国科学家LEVI博士就发现干细胞分泌的生物活性蛋白具有除皱作用，这些由多种生长因子组成的生物活性蛋白作用于皮肤真皮层的成纤维干细胞，使处于休眠、损伤的成纤维干细胞被激活和修复，并分化成大量成熟的成纤维细胞用于皮肤更新。

不论是干细胞临床研究和治疗，还是对干细胞分泌因子的开发，均需要大量扩增间充质干细胞，而原代细胞的活性和数量无疑是最关键的，但目前获取原代细胞的组织块直接贴壁法和酶消化法均略显不足。在酶消化法中，使用多种消化酶（CN102127522B、CN101575590B）进行长时间组合消化获取单细胞悬液（胰酶和胶原酶Ⅱ、Ⅳ），消化方式强烈，易对细胞膜造成破坏，致使细胞变形，增殖能力下降，传代次数减少；且多种酶组合消化的消化时间不易把握，最佳配比有待实验确认。此外多种酶的使用也增加了外源物质引入的风险。而单纯使用组织块培养法则培养时间过长，至少需要20天原代细胞才可以进行传代。原代培养时间的延长将会使细胞长时间暴露于体外环境，增加了细胞的不稳定性，使细胞易发生老化，增殖能力减弱，基因突变几率大幅增加。

在现有培养方法中，单次获得的干细胞及生物活性蛋白量远不能满足临床需求，而多批次培养则不可避免的存在批次间的差异性。因此，探索更为有效的干细胞培养和生物活性蛋白的生产方法对临床治疗具有十分重要的意义。

实际生产中多采用培养瓶或滚瓶培养的方式获得培养液来提取生物活性蛋白，但是这种培养方式获取的培养液体积少，多次换液存在污染的风险，且会增加批次间的不稳定性，无法满足规模化生产生物活性蛋白的需求。因此，安全有效地大规模培养干细胞尤其是大量生产生物活性蛋白被提上日程，而实现这一目标最有效的方法是利用生物反应器技术。