[发明专利]一条与猪瘟E0蛋白相结合的多肽序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，主要涉及猪瘟病毒E0结合多肽及其应用。

背景技术

猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV) E0糖蛋白既是包膜蛋白，又是一种核酸酶，其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系。在CSFV编码的蛋白中，囊膜蛋白E0和E2研究的最为清楚，因为这两个蛋白均位于病毒粒子的表面，对于一个有囊膜的病毒来说，镶嵌在囊膜中的糖蛋白对于病毒识别、吸附并进入宿主细胞是十分重要的。EO糖蛋白从病毒基因组ORF上第268个氨基酸开始到第494个氨基酸为止，共227个氨基酸，其甲基化程度很高，分子量为44-48Kda，依靠二硫键的连接二聚体的形式存在，分子量为97KD。真核细胞上普遍存在着可与E0结合的细胞受体，E0与细胞的结合为不可逆过程。

噬菌体展示技术是当前研究多肽与蛋白质作用的一种有效手段。这一技术将多肽的编码序列克隆到噬菌体壳蛋白的合适位置，并且要保证其正确的翻译序列，也不影响噬菌体壳蛋白的正常功能，这样噬菌体表达的壳蛋白结构中将会存在外源多肽的序列；伴随着噬菌体子代的重新组装，外源多肽序列将展示在噬菌体的表面。在一般情况下，外源展示的多肽具备一定的空间结构和生物活性，可以与相应的靶分子进行结合。展示肽库与靶蛋白分子结合后，洗去未结合的噬菌体，然后将与靶分子结合的噬菌体洗脱下来感染细胞扩增，经过3轮到6轮的“吸附-洗脱-扩增”，噬菌体与靶分子的结合特异性将逐步提高；经过多次筛选之后，最终可以筛选到与靶分子相结合的高亲和噬菌体。

发明内容

本发明借助噬菌体肽库展示技术，利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株，挑选其克隆株进行序列测定，其多肽序列为WRYDQ；人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，人工合成的多肽可与猪瘟病毒E0蛋白有良好的结合能力。借助本发明的多肽，可用于对猪瘟抗原进行定量和定性的检测。

本发明的技术方案：

一条可与猪瘟病毒E0蛋白结合的多肽序列为WRYDQ。

所述多肽序列为线性结合多肽。

所述的多肽序列中，包括以所述的多肽序列为核心，任何对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。

将所述多肽序列用于猪瘟的抗原检测，其中包括但不局限于酶联免疫反应检测。

所述的多肽序列在用于对猪瘟抗原进行定量和定性检测中的应用。

本发明的积极有益效果：

（1）本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株。挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为WRYDQ；人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，此人工合成的多肽可与猪瘟病毒E0蛋白有很好的结合；其亲和力可达5.54´10⁹L/mol。

（2）由于病毒难以纯化，因此针对病毒的抗体获得非常不易，本发明设计合成的多肽很好地规避了这一难题，可进行人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。

（3）本发明的人工合成多肽与人工接种CSFV、人工表达CSFV E0蛋白均可以结合，而且与其它病毒蛋白均不反应，特异性较高。

（4）本方法较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对猪瘟E0蛋白进行定性和定量检测。

附图说明

图1：利用多肽测定培养猪瘟病毒、表达蛋白的结果。

图中横坐标上，1为猪瘟病毒接种PK15细胞，2为表达猪瘟病毒E0蛋白，3 为PK15细胞对照；纵坐标为OD值。

图2：利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果。

图中横坐标为不同包被ELISA板细胞培养物的病毒各类；纵坐标为OD值。

具体实施方式

实例1 噬菌体随机肽库的筛选

用纯化表达的CSFV E0蛋白包被聚氯乙烯板，每孔100μl（100μl /ml）包被，置于4℃条件下过夜，用PBST洗涤后再用5%的BSA液封闭。

将稀释后的噬菌体肽库100μl加入到相应的孔中，室温条件下孵肓2h，用TBST液冲洗8-10次，每孔加入洗脱液200μl，室温条件下振荡5-8min，吸出洗脱液并中和至中性。

中和后的洗脱液可以用于滴度测定和下一轮培养；将LB培养后的噬菌体进行离心收集，用于下一轮的筛选。