[发明专利]重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种在富含高浓度葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中代谢适应生长的高产稳定表达细胞克隆的筛选方法，该方法用于灌流发酵过程中生产治疗性抗体。

背景技术

治疗性抗体是生物技术药物市场的主要类别(Walsh G，2014，Nature Biotechnology 2014，32:992-1000)。不同的治疗性抗体已经获得注册批准，用于治疗癌症、自身免疫病和其他慢性疾病，一些重组抗体也正处于不同的临床发展阶段(Biologic Medicines in Development,Phrma Report 2013，www.phrma.org)。迄今为止最畅销的抗体均靶向炎症性疾病。可以预见的医疗需求将远远超过全球现有抗体的产能。

用于规模化生产工艺的细胞系生产力是关键问题。基因扩增系统和细胞培养基优化已经被评价用于增加抗体生产率。已经报道基因修饰和重组骨髓瘤细胞系的遗传适应用于生产治疗性抗体(Barnes et al.，2000，Cytotechnology 32:109-123；Barnes et al.,2007,Biotechnol Bioeng 96:337-349)。

灌流发酵工艺允许在发酵收获液中高密度细胞培养来增加抗体浓度。但是，高密度细胞培养会因代谢需求而降低抗体生产速率。经肿瘤细胞增强的有氧糖酵解与促进生物分子合成和细胞持续生长的合成代谢有关系(Vander Heiden MG et al.,2009,Science 324:1029-1033；Levine AJ et al.,2010,Science 330:1340-1344)。生产重组抗体的NS0细胞克隆已经成功的适应在无蛋白质培养基中生长(WO2004/038010A1)。然而，适应无血清培养基和进一步无血清培养基中的长期发酵工艺通常伴随着细胞系生产力的损失(Barnes et al.,2003,Biotechnol Bioeng 81:631-639；Barnes et al.,2004，Biotechnol Bioeng 85:115-121)。而重组骨髓瘤细胞系的高密度细胞培养的代谢需求没有得到妥善解决。

适应在无蛋白质培养基中高产稳定表达的细胞克隆可以从工业化的不稳定重组骨髓瘤细胞系中重新获得(CN104152415A)。但是在实践中，一些重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白质培养基的适应过程伴随着抗体生成率的降低。稳定但低表达细胞系不适合工业灌流发酵工艺。增加抗体生产率而不导致抗体分泌不稳定是任何细胞系优化过程中的一个关键步骤。

生物药品通常是复杂的糖蛋白分子。单克隆抗体是由具有N-和O-糖基化位点的4条多肽链组成。生产工艺中任何变化都可能导致抗体分子理化性质的变化。在生物制药工业上可比较性概念出现用于评价产品属性上的变化(Demonstration of comparability of human biological products,including therapeutic biotechnology-derived products,Center for Biologics Evaluation and Research(CBER),Center for Drug Evaluation and Research (CDER)April 1996；EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances:Quality issues(CPMP December 2003)；ICH Q5E:Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process.EU:Adopted by CMPM,December 1,2004,CPMP/ICH/5721/03,date for coming into operation:June 2005；MHLW:Adopted 26 April 2005,PFSB/ELD Notification No.0426001；FDA:Published in the Federal Register,Vol.70,No.125,June 30,2005；37861-2)。