[发明专利]一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

自从人类基因组计划完成以后，生命科学研究进入了后基因组时代，而后基因组时代的核心工作是研究基因的功能。目前，研究基因功能最有效的方法是基因打靶(基因敲除和基因敲入)技术。基因打靶技术是近年来在生命科学研究领域发展起来的一项新技术，它是在胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术和同源重组技术的基础上发展起来的，可以定向操作和改变基因，然后通过观察和分析被改变基因动物的表型来获得基因功能的信息。基因打靶技术还有另外一种重要用途——制作人类疾病的动物模型。

现有研究显示，人类很多疾病是由于基因突变引起的，基因打靶技术可以精确操纵动物染色体上的基因，从而制作出具有同人类疾病完全一样病症的动物模型，这对于查清人类疾病的致病机理，特别是在寻找治疗人类疾病的特效药物方面有非常重要的实践意义。

美国北卡洛莱娜大学Oliver Smithies由于两项科学贡献而获得了2007年Nobel生理学医学奖，一是把基因打靶所需的同源重组技术首先应用在哺乳动物细胞中，二是使用基因打靶技术制作了一些人类疾病的动物模型。他在诺贝尔颁奖大会上演讲的题目就是“让我们制作更多的人类疾病动物模型”。

腭裂(Cleft Palate,CP)是在新生儿中较为常见的先天性颅面部发育畸形，全世界范围内新生儿发病率为1/700，而在我国新生儿中的发病率为1.82‰，中国是目前世界上唇腭裂患者数量最多的国家之一。腭裂的病因极其复杂，对腭裂的发病原因及其发病机制仍不清楚。因而，目前迫切需要提供一种可用于腭裂发病机制研究的小鼠模型。LOXL3(lysyl oxidase-like3)是赖氨酰氧化酶家族成员之一。赖氨酰氧化酶是一种细胞外铜依赖氨基酸氧化酶。在人和多种动物中，赖氨酰氧化酶能将胶原和弹性蛋白中特定赖氨酸的ε-氨基氧化脱氨从而使二者交联，而这两者又是主要的细胞外基质结构蛋白。胶原蛋白是参与腭的发育的重要蛋白，而且已有研究表明抑制胶原的交联将导致腭裂的形成。小鼠Loxl3基因定位在6号染色体上。目前，有关小鼠Loxl3基因的敲除还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法，出生后纯合敲除小鼠表现腭裂症状，包括如下步骤：

构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，

线性化重组载体并转染胚胎干细胞，

筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，

将筛选出的发生同源重组的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚，

将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠，

嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠，

将该杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配，获得双杂合的小鼠，

雌性和雄性双杂合小鼠互交，从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠。

根据本发明优选的，所述的构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，步骤如下：

(1)提取含有loxl3基因的细菌人工染色体(BAC)；

(2)PCR扩增六段同源重组片段，所述的引物序列分别为：

同源重组片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；

R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；

同源重组片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；

R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；

同源重组片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；

R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；

同源重组片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；