[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白T基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白T及其编码的蛋白的氨基序列，属于生物基因技术领域。

背景技术

细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)，在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。

细胞周期蛋白T(Cyclin T)是细胞转录的重要调控因子，和细胞周期蛋白依赖性激酶9(cyclin dependent kinase 9，CDK9)等组成正性转录延长因子b(positive transcription elongation factor b，P-TEFb)参与细胞转录延伸反应的正性调控。Cyclin T和CDK9组成的P-TEFb协同CDK8、cyclin C、cyclin K、RNA聚合酶II(POLR2A)、负性调控因子(DSIF、NELF)等共同调控细胞转录，保证细胞功能的正常发挥。目前已知的cyclin家族成员以A-J进行编号，共有约15种，其中cyclin T作为转录的重要调控因子，在艾滋病、心肌肥大、肿瘤等疾病中有较深入的研究。Cyclins不仅是CDKs的激活亚基，而且是复合体(cyclins/CDKs)与其他基团或者调节因子直接作用时的识别效应器。1995年，人们首先从果蝇中分离纯化出P-TEFb，通过实验进一步确认了其成分主要是cyclin T和CDK9等。近几年的研究表明，cyclin T是胚胎正常发育、细胞生长与分化以及艾滋病病毒(HIV-1)转录复制等过程必不可少的关键因子之一，其功能和作用机理是目前研究的热点。随着细胞周期蛋白研究的不断广泛和深入，cyclin T在一些物种中相继被克隆出来，如人(Homo sapiens，AAC39638.1)、小鼠(Mus musculus，AAD17205.1)、果蝇(Drosophila melanogaster，AAC73052.1)、斑马鱼(Danio rerio，XP_005167592.1)和印度跳蚁(Harpegnathos saltator，EFN77646.1)等，但该基因在对虾中尚未研究。

斑节对虾是世界三大对虾养殖品种之一，人工育种过程中广泛采用的剪除单侧眼柄催熟卵巢的技术会导致亲虾的高死亡率和产卵质量低等问题。人们对于卵巢成熟促进因子(Mature Promoting Factor，MPF，cyclin B/CDC2)的研究揭示细胞周期蛋白在对虾卵巢发育中具有重要的潜在研究价值。

发明内容

本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白T基因的全表达序列；此外通过斑节对虾细胞周期蛋白T基因设计荧光定量PCR引物，对周期蛋白T在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究分析，为研究斑节对虾细胞周期蛋白T在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础。

本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白T基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组织，并分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、斑节对虾细胞周期蛋白T的PCR扩增、克隆