[发明专利]斑节对虾热休克蛋白60基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾热休克蛋白60基因及其编码的蛋白，属于生物基因技术领域。

背景技术

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是高水平基础表达的一种蛋白，占在正常生长条件下所有类型细胞中蛋白总量的5％-10％。当细胞处于应激条件时(如重金属、热休克、周围气温的变化、糖分损失、游离自由基的作用、病原体传染、组织损伤、精神和生理逆境等)热休克蛋白表达量明显提高。根据分子量的不同，热休克蛋白主要划分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、和smHSP五个家族。

HSP60作为一种分子伴侣，其重要的生物功能已日益引起人们的重视，尤其是在细胞保护方面。HSP60提高细胞的“应急耐受”能力，帮助变性、不可溶的凝聚蛋白重新恢复天然构象。此外，HSP60在许多病原体传染过程中都是一种免疫优势抗原，在先天免疫中发挥重要的作用。

免疫分子机理的研究对斑节对虾养殖有着举足轻重的地位，对HSP参与的免疫原理进行探究，阐明病害的发生机制，对斑节对虾的繁育和养殖有着重要的作用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾热休克蛋白60基因的全表达序列；此外通过斑节对虾热休克蛋白60基因设计原核表达引物，对热休克蛋白60在体外进行重组表达，为研究斑节对虾热休克蛋白60在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应。

本发明提供的热休克蛋白60基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取卵巢组织，并将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(oligo-dT/adaptor(5′-GGCCACGCGACT AGTAC(T)16-3′)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、引物设计依据，引物合成的方法

根据已有的斑节对虾热休克蛋白60的EST序列设计引物：

Pm-HSP60cDNA全长扩增及表达所用的引物

引物设计后提交华大基因公司进行合成。

4斑节对虾热休克蛋白60基因的PCR扩增、克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板,利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3ˊ末端进行PCR扩增。

在3ˊRACE中，利用降落PCR(touchdown PCR)方法，用接头引物：

5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3和HSP60-F1、HSP60-F2进行PCR扩增。

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。

5、对斑节对虾热休克蛋白60基因的测定

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾热休克蛋白60基因同源序列。

6、斑节对虾热休克蛋白60利用大肠杆菌进行体外重组表达