[发明专利]斑节对虾热休克蛋白10基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾热休克蛋白10基因及其编码的蛋白，属于生物基因技术领域。

背景技术

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又称应激蛋白，是机体细胞在一些应激原(如环境高温、缺氧、重金属中毒、氧化应激、感染、饥饿、创伤、代谢毒物等)的诱导下，使HSP基因被激活，且高效表达的一组在进化上高度保守的蛋白质，对机体免受应激因素的损害具有重要作用。

HSP10是小分子质量HSP家族的重要一员，它作为一种分子伴侣蛋白时，与HSP60一端或两端连接，扩大HSP60分子内腔对蛋白质进行初步折叠。HSP10也有促进细胞增殖、抑制凋亡的作用，2010年He等人研究表明HSP10具有抑制生殖细胞凋亡的作用。高表达HSP10可抑制生殖细胞凋亡；HSP10在细胞受到高温、紫外线、药物、缺氧等刺激下大量表达，是调节细胞凋亡的关键信号通路，抑制细胞凋亡的发生，发挥保护细胞作用。在生殖方面，HSP10参与卵巢颗粒细胞凋亡的调节，进而可能影响卵泡及卵母细胞的发育成熟；2008年Walsh等人发现HSP10通过直接组装精子表面的透明带受体复合物，参与精子与透明带的识别过程，进而影响精子与卵母细胞的受精过程。此外，HSP10还参与炎症、免疫过程以及生殖相关。

近年来随着生态环境的恶化，水产养殖行业受到了严重的影响，而水产养殖对环境的稳定性要求相对较高，特别是斑节对虾的繁育与养殖。因此，为了繁育出高抗逆性优良品质的斑节对虾，对其生长、生死、免疫相关分子机理的研究显得尤为重要。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾热休克蛋白10基因的全表达序列；该序列不仅为研究斑节对虾热休克蛋白10在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应答效应从分子层面提供理论基础。

本发明提供的热休克蛋白10基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取卵巢组织，并将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀 浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(oligo-dT/adaptor(5′-GGCCACGCGACTAGTAC(T)16-3′)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、引物设计依据，引物合成的方法

根据已有的斑节对虾热休克蛋白10的EST序列设计引物：

Pm-HSP10cDNA全长扩增及表达所用的引物

引物设计后提交华大基因公司进行合成。

4、斑节对虾热休克蛋白10基因的PCR扩增、克隆 

以上述合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3ˊ末端进行PCR扩增。

在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接头引物5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3)和HSP10-F1、HSP10-F2进行PCR扩增。

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。

5、斑节对虾热休克蛋白10基因的测定 

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾热休克蛋白10基因同源序列。

6、斑节对虾热休克蛋白10利用大肠杆菌进行体外重组表达