[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因及其编码的蛋白，属于生物基因技术领域。

背景技术

细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)，在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。

细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)是细胞周期调控重要的因子之一，参与调控Gl/S的转变和S期的进程。正常情况下除Gl后期和S期外，CDK2在细胞核和细胞质中等量分布。G1后期大量CDK2进入细胞核直接与cyclinE亚基结合，形成Cyclin E/CDK2复合物，可促进视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRB)的磷酸化，释放转录因子E2F，促进细胞周期Gl/S期的转变。Cyclin E/CDK2推动细胞进入S期后即被蛋白酶水解，解离出来的CDK2将与CyclinA结合并作用于其下游底物以促进S期的顺利完成，实现对细胞周期的准确调控，进而可以实现对卵巢发育的调控。

长期以来，斑节对虾亲虾的人工繁育问题一直都是限制斑节对虾养殖产业发展的技术瓶颈。在实际生产过程中，亲虾的性腺成熟参差不齐，难以集中育苗的问题是对虾养殖过程中一个非常重要的限制因素。眼柄切除手术作为促进亲虾性腺同步成熟的常用方法，对亲虾本身存在非常大破坏性，不利于可持续养殖，加大了养殖成本。因此出于寻求一种新的对虾繁育方法的需求，对对虾卵巢发育机理及其分子调控机理进行研究势在必行。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因的全表达序列；通过斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因设计荧光定量PCR引物，对细胞周期蛋白依赖性激酶2基因在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究分析；根据斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因设计原核表达引物，在体外通过大肠杆菌为载体成功获得重组的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2。

本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、精巢、淋巴等组织，并分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5′-GGCCACGCGACTAGTAC(T)16-3′)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、引物设计依据，引物合成的方法

根据已有的细胞周期蛋白依赖性激酶2的EST序列设计引物：Pm-CDK2cDNA全长扩增及表达所用的引物

引物设计后提交华大基因公司进行合成。

4斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2的PCR扩增、克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)对目的基因的3ˊ末端进行PCR扩增。

在3ˊRACE中，利用降落PCR(touchdown PCR)方法，用接头引物：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3和K2B F、K2B R进行PCR扩增。

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。

5、对斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因的测定