[发明专利]微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及低温葡甘聚糖酶微生物发酵生产的方法。

背景技术

葡甘聚糖酶(Glucomannanase)是一种能将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖(konjac oligo-saccharide,KOS)的可诱导细胞外泌酶(董桂清，β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究，广西轻工业，2007)。葡甘低聚糖属于功能性低聚糖，具有极其显著的降脂作用，可以作为高血脂、糖尿病辅助治疗产品(Hsiao-Ling Chen，Konjac Supplement Alleviated Hypercholesterolemia and Hyperglyeemia in Type 2Diabetic Subjects—A Randomized Double-Blind Trial，Journal ofthe American College ofNutrition，2003)；因其能够减少肠内氨的生成和吸收，可以减轻肝脏对血氨的解毒负担(陈黎，魔芋低聚糖降胆作用的初步研究，中国生化药物杂志，2003)；同时葡甘低聚糖能够提高体内超氧化物歧化酶活性，增强机体抗氧化能力(杨艳燕，魔芋低聚糖对小鼠血糖含量和抗氧化能力的影响，中草药，2001)。但是目前有关葡甘低聚糖产品，只有少量出现在国外市场，国内基本无此类产品(周海燕，发酵生产魔芋葡苷聚糖酶，中国生物工程杂志，2005)。

国内对于葡甘聚糖酶的研究尚处于起步阶段，主要包括菌种选育、产酶条件优化、酶分离纯化、酶学性质、基因克隆等(周海燕，高活性魔芋葡甘聚糖酶产生菌B23的鉴定及培养条件优化，湖北农业科学，2005；董桂清，β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究，广西轻工业，2007；许剑，一株产常温葡甘聚糖酶的芽孢杆菌的分离、鉴定及产酶发酵条件的研究，基因组学与应用生物学，2012；)。微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的产业化、规模化生产及应用还未见报道。

微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶与中、高温葡甘聚糖酶相比具有很大的应用优势，低温葡甘聚糖酶的应用将对传统的食品、医药等领域产生深远的影响。微生物发酵葡甘聚糖酶工业化生产可创造良好的经济效益和社会效益(周海燕，发酵生产魔芋葡苷聚糖酶，中国生物工程杂志，2005)。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法，该方法是将微生物经过低温驯化后，在18～24℃液体培养基中发酵生产低温葡甘聚糖酶再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。本发明的技术方案如下：微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法具体包括以下步骤：

(1)将能产生葡甘聚糖酶的菌种活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，24℃→22℃→20℃→18℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基按重量百分比计包含：魔芋精粉0.4～1.0％，NaNO₃0.2～0.7％，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.5％，KCl 0.3～0.5％，K₂HPO₄0.1～0.3％，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.004％，琼脂1.8～2.0％，自来水100mL，pH 6.0～6.5，于115℃、0.1Mpa蒸汽灭菌15min；

所述的能产生葡甘聚糖酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.1918或1.439或1.440或1.460；

(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基中于18～24℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述液体种子培养基按重量百分比计包含：魔芋精粉0.4～1.0％，酵母膏0.4～0.9％，蛋白胨0.3～1.0％，NaNO₃0.2～0.7％，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.5％，KCl 0.3～0.5％，K₂HPO₄0.1～0.3％，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.004％，自来水100mL，pH 6.0～6.5，于115℃、0.1Mpa蒸汽灭菌15min；