[发明专利]海洋微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温脂肪氧合酶海洋微生物发酵生产方法。

背景技术

脂肪氧合酶(Lipoxygenase,EC 1.13.11.12,简称LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶，其催化生成的不饱和脂肪酸氢过氧化物，是面粉增白剂和增香剂、抗肿瘤药物前体、涂料与洗涤剂等的生产原料，是重要的药物合成和化学合成中间体，具有巨大的市场需求。工业使用LOX大多是植物来源的LOX，绝大部分来源于大豆。由于工艺成本的限制，大豆提取的LOX往往含有多种同工酶，对控制其催化产物特性非常不利(Casey R,et al.Food Biotechnol,2005)。与传统提取法相比，海洋微生物发酵得到的LOX性能稳定，其良好的同质性受到了越来越多的关注。现阶段国内外对微生物来源LOX的研究主要集中于中温LOX，研究内容包括菌种选育、发酵优化(陆信曜，食品科技，2013)、酶学性质、结构及催化特性、固定化、基因的克隆与表达以及酶蛋白分子改造等方面(Casey R,et al.Trends Food Sci Tech,1999；Koeduka T,et al.Curr Microbi-ol,2007；张充等，生物工程学报，2012；章栋梁等，核农学报，2012；Hansen J,et al.Appl Microbiol Biot,2013；王广圣等，食品科技，2014等)，低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可减少加工工艺，缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用，在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(陈秀兰等，中国农业科技导报，2007)。因此，低温LOX同样具备的上述特性将有助于其推广和应用，具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势。目前，还未见有关海洋微生物发酵生产低温LOX、低温LOX产业化、规模化生产的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10～18℃液体发酵培养基中发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，这种生产方法获得的低温脂肪氧合酶粗酶液酶活可以达到170U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。

本发明的技术方案如下：微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法具体包括以下步骤：

(1)将能产生脂肪氧合酶的菌种活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；该菌种的低温驯化培养基为：蛋白胨5.0～15.0g，亚油酸2.0～10.0g，NaCl 5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH值为6.0～8.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；

所述的能产生脂肪氧合酶的微生物来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.228或1.239或1.2620；

(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在液体种子培养基中于10～18℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基:酵母膏10.0～20.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，自来水1.0L，pH值为6.0～8.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min

(3)将液体二级种子按发酵液体积3～9％的接种量接入液体产酶培养基中，在10～18℃培养72～144h时，即海洋微生物发酵生产低温脂肪氧合酶结束；所述的液体产酶培养基:牛肉膏3.0～10.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，Tween800.1～0.4g，(NH₄)₂SO₄1.0～1.5g，KH₂PO₄1.0～2.0g，MgSO₄0.1～0.5g，CaCl₂0.1～0.3g，ZnSO₄·7H₂O 2.4～3.0mg，自来水1.0L，pH值为6.0～7.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；