[发明专利]一种培养脐血类胚胎干细胞的方法及鉴定和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养干细胞的方法及鉴定和应用。

背景技术

Ⅰ型糖尿病(旧称青少年糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)是糖尿病的一种类型，它与Ⅱ型糖尿病的发病机理完全不同，属于自体免疫性疾病，可能是由于自体免疫系统破坏产生胰岛素的胰腺胰岛β细胞引起的。根据国际糖尿病联合会(IDF)于2009年发布的数据，全世界目前约有3000万1型糖尿病患者。

Ⅰ型糖尿病主要有以下几点患病因素：1)遗传因素：国外报道约有25％～50％的人是由于遗传因素导致患病，遗传因素不论Ⅰ型或Ⅱ型均较肯定。据近代孪生儿研究，Ⅰ型中共显性为50％，其余为环境因素；Ⅱ型中共显性更高达90％以上。与I型糖尿病发病有关的是人类白细胞抗原(HLA)基因，HLA基因位于人类第6号染色体断臂上，共有HLA—A、B、C、D(DR、DQ、DP)6个基因位点。HLA-A、B、C为I类抗原，正常时I类抗原基因可在所拥有核细胞表面(包括胰岛素B细胞表面)表达，参与细胞介导免疫。HLA.D系列为Ⅱ类抗原，正常时只在B淋巴细胞、激活的T淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞表面表达，胰岛β细胞表面表达与自身免疫发病有关。大量HLA研究总结认为HLAD及DR抗原与Ⅰ型的关联最为重要，尤其是DW3-DR3和DW4-DR4易患Ⅰ型糖尿病。最后又发现DQβ链变异体，与Ⅰ型糖尿病的关系较DR4更密切。DQβ57非天门冬氨酸和DQα52精氨酸可明显增加Ⅰ型糖尿病的易感性，但其影响远不如白种人显著。Ⅱ型患者则HLA无特殊标志。2)自身免疫：与Ⅰ型患者关系密切。胰小岛的自身免疫反应主要可能通过分子模拟(Mimicry)过程所致。如某抗原的化学和构成型与β细胞酷似，则该抗原产生的抗体也将针对β细胞发动免疫攻击。抗原可以是病毒，也可以是病毒以外的。至于病毒感染后，β细胞严重破坏而发生糖尿病的学说，在流行方式和病毒血清学研究中尚存在不一致。3)化学物质：对胰岛β细胞有毒性的药物和化学物质有四氧嘧啶、链脲佐菌素(STZ)戊双咪、苯丙噻二嗪、噻唑利尿酮以及吡啶甲硝苯脲等均可损伤胰岛β细胞，抑制胰岛素的合成与分泌。

自胰岛素发现以来，皮下注射外源胰岛素一直是治疗l型糖尿病的最主要手段，虽然近年来随着胰岛素缓释泵技术及基因工程改造的长效胰岛素的广泛应用，I型糖尿病患者的血糖控制效果较之前有了很大提高，但是I型糖尿病是一种机体免疫系统异常攻击坏胰腺中产生胰岛素细胞的疾病，这种方法既不能改善胰岛功能也不能纠正异常免疫系统，所以无法达到治愈效果。在过去20多年中，随着分子生物学技术的发展，科研工作者一直在尝试用干细胞治疗糖尿病，以恢复体内胰岛素长期的合成与分泌，实现I型糖尿病在治愈水平上的技术突破。

1991年，加拿大阿尔贝塔大学医学院完成了世界上首次人胰岛移植实验。在使用抗免疫球蛋白、糖皮质激素、咪唑硫嘌呤等免疫抑制剂后，成功地将纯化的人胰岛细胞和一个肾脏移植入一名具有25年糖尿病史的35岁患者体内。手术后的几个月内，患者完全摆脱了对外源胰岛素的依赖。尽管由于I型糖尿病患者体内存在针对胰岛细胞的抗体、机体自身的排异反应及免疫抑制剂对β细胞本身的毒害作用，接受胰岛移植的患者在几个月后又开始接受胰岛素治疗。但该手术的成功还是使人类在彻底根治I型糖尿病上迈出了历史性的一步，也为糖尿病患者彻底摆脱依靠每天注射胰岛素缓解病症带来了希望。在经过了近十年的探索后，阿尔贝塔大学医学院的Shapiro及其同事于2000年在最权威的医学刊物《新英格兰医学杂志》上报道：在使用不含糖皮质激素的一类包括sirolimus、taerolimis及daclizumab在内的新型免疫抑制剂的条件下，将分离的人胰岛注射入糖尿病患者的肝门静脉内，可以使胰岛附着在肝窦区域并分泌胰岛素。接受这种胰岛移植的患者在平均11.9个月内(4.5一15个月)完全摆脱了对胰岛素的依赖(Shapiro等.2000)，但是大部分患者在移植1年以后又开始接受外源胰岛素治疗，接受了胰岛移植的患者不依赖胰岛素的时间最长已经超过了5年，这种胰岛移植的方法被称为Edmonton protocol。Edmonton protocol还存在非常致命的缺点，包括sirolimus(rapamycin)对β细胞的毒性作用、胰岛用量相对较大及纯化过程的胰岛应激损伤、同源胰岛来源困难、移植后胰岛存活率低、免疫抑制剂的副作用及移植成本高昂等。异种(如猪源)胰岛移植研究历史较长，但是也存在引入异种遗传疾病和传染性疾病的风险，且遭到有宗教信仰阶层的排斥，因此虽是研究应用的一大方向，但是世界上目前并未有成熟的产品出现。