[发明专利]利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种灵芝蛋白的抗氧化多肽及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

食品营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营养价值，引起食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食品行业中。但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把目光转向天然抗氧化剂。α-生育酚是一种被最普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天然抗氧化剂。

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，使蛋白质具有一定的生理功能。在人类的生命活动中，肽在体内的消化吸收优于游离的氨基酸，且有着区别于氨基酸的体内输送体系。某些短肽在提供人体生长、发育所必需的营养物质的同时，还能够防病治病，调节人体机能，这些具有生物活性的多肽被称为生物活性肽。研究发现，很多不同来源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料种子蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。

灵芝(Ganoderma lucidum)属于担子菌纲多孔菌目灵芝科，是灵芝属中分布最广的物种，因其子实体中含有大量的药理成分，而被视为极珍贵的药用真菌。灵芝多肽是一类重要活性物质。 我国拥有丰富的灵芝资源， 灵芝中含有丰富蛋白质，利用现代生物技术对蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类等，通过工艺优化生物活性肽的产品得率将使得生物活性肽的研究具有更广阔的前景。

发明内容

本发明提供了一种灵芝蛋白的抗氧化多肽及其制备方法，使抗氧化活性得以高效地实现。

本发明的一种抗氧化多肽，氨基酸序列为DVVKNAACG。

本发明还提供了一种抗氧化多肽的制备方法，以灵芝为原料提取蛋白，然后采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽；所述酶解条件为：pH为8.0、温度45℃、酶解时间为9h、酶-底物配比为3000U/g；所述酶为碱性蛋白酶。所述分离纯化的手段包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。

所述分离纯化的具体步骤为：

（1）酶解产物首先利用分子量截留范围为10000Da和5000Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000Da的组分、分子量介于10000Da和5000Da的组分、分子量小于5000Da的组分；（2）收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－盐酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，将分离出来的最好的抗氧化活性组分利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含体积分数为10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至体积分数为90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积分数为43%乙腈和57%水（v/v）处的洗脱峰,得到本发明的高纯度的抗氧化多肽。利用蛋白质固相序列分析仪鉴定多肽的氨基酸序列，得到本发明的抗氧化多肽的氨基酸序列为：DVVKNAACG。

为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下：

灵芝蛋白的提取

本发明所采用的灵芝蛋白为异样发酵获得。

灵芝蛋白质提取工艺条件为：将灵芝清洗3-5次， 超声波破碎，浸提。浸提pH为 8.0，料液比为20:1（重量比）。浸提时间12h，离心10000g 20分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到灵芝蛋白。