[发明专利]一种检测水体中重金属铜的微生物学方法

权利要求书

1.一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WMC-007 CGMCC No.9750应用于水体重金属铜的检测。

2.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-007工程菌株的构建方法如下：

2.1采用Red重组系统，敲除野生型大肠埃希氏菌E.coli MC4100基因组中三个铜离子外排泵基因：copA、cueO和cusA，构建对铜离子高度敏感的E.coli copA-cueO-cusA-突变菌株；copA，序列如SEQ ID NO.1所示，cueO，序列如SEQ ID NO.2所示，cusA，序列如SEQ ID NO3所示；

2.2采用基因融合和基因敲入技术将不含启动子的增强型绿色荧光蛋白gfpmut2报告基因置换到E.coli copA^-cueO^-cusA^-菌株基因组中copA基因编码框位置，并通过菌落PCR及测序鉴定筛选获得目的菌株；copA_p启动子序列为SEQ ID NO.4所示，gfpmut2序列为SEQ IDNO.5所示，基因copA两侧DNA片段copA_No-Ni和copA_Ci-Co进行扩增，扩增引物序列为SEQ IDNO.6-9所示，基因gfpmut2进行扩增，扩增引物序列为SEQ ID NO.10-11所示。

3.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-007性能的测定与参数优化如下：

3.1 E.coli WMC-007菌株对铜离子的检测线性范围广，可以检测0.0157-6mg/L范围的铜离子，并且能够保持高度专一性；

3.2荧光分光光度计与流式细胞术分析表明，大肠埃希氏菌工程菌株E.coli WMC-007具有荧光本底值低、操作简便、检测时间短、检测信号稳定和独立实验重复性好的优势。

4.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-007检测水体中重金属铜的微生物方法，包含以下步骤：

4.1环境水体样品测定的准备：

取10-50ml待测环境水体样品，12,000g离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为6-8，再用0.2微米的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定；

4.2标准曲线测定的准备：

把铜单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度； 具体的浓度需根据样品中Cu的浓度而定； 初次检测可以检测0.025、0.05、0.5、1、2.5、5mg/L这几个标准品浓度，在后续的实验中根据样品中Cu的浓度对标准品的浓度进行适当调节；

4.3 LB培养基的配制：

按照步骤4.1每个样品或标准品需300μl-3ml LB培养基的比例配制适当量的LB培养基；LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的无菌400mmol/L MOPS缓冲液后均匀混合；

4.4标准曲线的制定及步骤4.1样品Cu浓度的测定：

4.4.1取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到上述LB培养基中，使菌液起始OD600值为0.02，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl水体样品或铜单元素标准品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品或标准品各做3个平行孔或3个平行管；37℃、250rpm振荡孵育2-5h；4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml含500mM NaCl，20mM Tris-HCl和20μg/ml氯霉素的pH 8.0 DB缓冲液中；

4.4.2将步骤4.4.1重悬菌液稀释0-20倍，使E.coli WMC-007全细胞悬浮液的OD600小于0.3，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD600值；

4.4.3数据处理：

相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFU_M＝F_M/OD600_M，F_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的荧光值，OD600_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的吸光度；RFU_W＝F_W/OD600_W，F_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的背景荧光值，OD600_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的吸光度；

绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFU_M-RFU_W，RFU_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的相对荧光值，RFU_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的相对背景荧光值；

4.4.4以步骤4.4.1铜单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，铜单元素标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合获得标准方程，将测得水体样品的绝对荧值代入方程，计算得到水体样品中铜的浓度。