[发明专利]一种重组狂犬病病毒的构建及培养方法

说明书

技术领域

本发明涉属于重组疫苗领域。尤其涉及一种表达3G基因重组狂犬病病毒的构建。

背景技术

狂犬病是一种很重要的人畜共患病，每年约造成60000人死亡。在很多辅助中构建，狗仍是造成人感染狂犬病的主要原因，而在发达国家，狂犬病病毒主要存在于野生动物宿主。实践证明，对动物如狗进行免疫能显著降低人狂犬病的发病率，因此对动物实施免疫对控制狂犬病及为重要。

狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，基因组是不分节段的单股负链RNA，全长约12Kb，编码5种病毒蛋白：核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。位于囊膜上的糖蛋白G是主要的致病因子，同时也是诱导保护性免疫反应的主要抗原。

目前，狂犬病病毒SAD Bern(Sanafox)株在欧洲一直作为野生动物狂犬病免疫的活疫苗，其具有较高的保护性和安全性。鉴于弱毒活疫苗在使用过程中存在较大的安全隐患，我国农业部规定狂犬病的预防必须使用灭活疫苗。

为获得高效的、免疫原性更佳的狂犬病毒毒株，本研究利用反向遗传技术构建了一个含有3个同源G基因的狂犬病病毒。我们鉴定了该重组病毒株的生物学特性，并将其与亲本毒株SAD Bern(Sanafox)进行了比较。结果表明重组病毒RV-r3G与rSAD Bern(Sanafox)相比具有更好的安全性和免疫原性，适用于狂犬病毒灭活疫苗的开发。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种狂犬病毒毒株的构建及培养方法，该毒株的免疫原性更佳。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种重组狂犬病病毒株，它是在对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得的狂犬病病毒基因组中插入2个狂犬病病毒G基因，得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，即RV-r3G狂犬病病毒。

其中，所述的对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得狂犬病病毒基因组包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到8个互补DNA片段F1～F8；将所述的8个互补DNA片段F1～F8进行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因组。

优选地，所述狂犬病病毒基因组F1段的5’端引入PmeI酶切位点和锤头状核酶(HamRz)、在F8的3’端引入NotI酶切位点和丁肝病毒核酶。

其中，所述2个狂犬病病毒G蛋白根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列获得，具体包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到G基因；通过对G基因进行扩增，得到所述的2个狂犬病病毒G基因；通过PCR重叠技术，将所述的2个狂犬病病毒G基因串联在一起，得到2G基因。

为实现本发明的目的，本发明另一方面提供一种重组狂犬病病毒株的构建及培养方法，包括以下步骤：

对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作，获得狂犬病病毒基因组；

根据SAD Bern全基因组序列，得到2个G基因；

将所得到的2个G基因插入到所述狂犬病病毒基因组中，得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组狂犬病病毒。

其中，所述的对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作，获得狂犬病病毒基因组包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到8个互补DNA片段F1～F8；对所述的8个互补DNA片段F1～F8进行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因组。

特别是，在所述狂犬病病毒基因组F1段的5’端引入PmeI酶切位点和锤头状核酶(HamRz)、在F8的3’端引入NotI酶切位点和丁肝病毒核酶。

其中，所述的根据SAD Bern全基因组序列得到2个G基因包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到N基因、P基因、L基因和G基因；通过对所述G基因进行扩增，得到所述的2个狂犬病病毒G基因；通过PCR重叠技术，将所述的2个狂犬病病毒G基因串联在一起，得到2G基因。

其中，将2个G基因插入到所述狂犬病病毒基因组中包括：利用限制性内切酶与连接酶，将所述狂犬病病毒基因组及N基因、P基因、L基因、G基因分别连接到质粒pcDNA中，分别得到SAD Bern(Sanafox)基因组全长cDNA克隆质粒pcDNA-SAD和辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G。将所述2G基因在所述克隆质粒pcDNA-SAD中的G基因与L基因之间进行插入，获得含有3G基因的重组全长质粒pcDNA-SAD3-3G。