[发明专利]一种快速检测表皮葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，具体为一种表皮葡萄球菌的特异基因的发现及其应用于表皮葡萄球菌检测技术方法的建立。

背景技术

表皮葡萄球菌是存在于皮肤表面的条件致病菌，其引起败血症，慢性前列腺炎的趋势以日俱增。表皮葡萄球菌的耐药现象非常严重，临床上治疗表皮葡萄球菌所致疾病较为棘手。因此，快速检测出表皮葡萄球菌就显得尤为重要。

目前临床应用的表皮葡萄球菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动分析鉴定系统等，但是这些方法都存在一定的缺陷，如常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，但其非常耗时，不能实现快速的目的；免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；近年来，仪器自动化分析鉴定系统不断面市，但这些鉴定系统大多数应用面较窄，费用昂贵。

本发明利用生物信息学寻找出表皮葡萄球菌特异基因，并针对其设计引物，建立了表皮葡萄球菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出表皮葡萄球菌的目的。

发明内容

本发明针对现有技术对表皮葡萄球菌检测技术的缺陷，目的在于提供一种高特异高敏感检测的快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过物信息学手段获取可用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并设计可以特异性检测表皮葡萄球菌的引物，利用聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过生物信息学手段获取用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果。

本发明所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因为DeoR family transcriptional regulator，该基因Genbank登陆号为3240916，为表皮葡萄球菌特有，基因序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明所述的PCR反应体系为：25μL，Taq 0.125μL，10×聚合酶缓冲液2.5μL，dNTP 2μL，Mg²⁺1.6μL，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH₂O补足25μL。

本发明所述的PCR反应程序为：1)预变性：95℃5min；2)30个循环：95℃30s，59℃30s，72℃20s；3)后扩增：72℃1min。

本发明快速检测表皮葡萄球菌的方法在Mg²⁺为1.6mM，退火温度为59℃条件下进行。

所述引物组合物与鉴定表皮葡萄球菌的基因的246位至705位的核苷酸序列或其互补链互补。

本发明还提供了一种用于应用聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的引物组合物，所述的引物组合物为：上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了基因DeoR family transcriptional regulator(Gen bank登陆号为3240916)用于鉴定表皮葡萄球菌的用途。

本发明的有益效果为通过本地Blast比对和分析，获得表皮葡萄球菌的特异基因，针对特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测表皮葡萄球菌。

附图说明

图1是不同退火温度和Mg²⁺浓度下检测表皮葡萄球菌电泳图；A为退火温度49℃；B为退火温度51℃；C为退火温度53℃；D为退火温度55℃；E为退火温度57℃；F为退火温度59℃；M为2000bp marker，1～5依次为0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mM；

图2是Mg²⁺为1.6mM、退火温度为59℃的条件下检测表皮葡萄球菌电泳图；M为2000bp marker，1至3为三株表皮葡萄球菌，4为肺炎克雷伯菌，5为弗劳地氏枸橼酸杆菌，6为伤寒杆菌，7为琼氏不动杆菌，8为大肠杆菌，9为粪肠球菌，10为溶血葡萄球菌，11为金黄色葡萄球菌，12为摩氏摩根菌；

图3是检测不同表皮葡萄球菌浓度的电泳图；M为2000bp mar ker，0至9分别为为100个/μL至109个/μL，C为阴性对照。

具体实施方式