[发明专利]一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法

权利要求书

1.一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）外植体消毒：采集钝叶瓦松健康植株带芽茎段，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒3～8min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用;

（2）愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后的带芽茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～20小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成愈伤组织,培养2周后统计污染率、启动率和死亡率;

（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm³大小并接种于增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～7天，然后置于每天光照13～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养，30天后统计愈伤组织的增殖倍数,多次反复切割进行继代培养，以得到更多的愈伤组织;

（4）分化培养：将步骤（2）或（3）诱导培养得到的愈伤组织切割成0.5cm³大小并接种于分化培养基上进行丛生芽诱导培养,接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～16小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽,接种后定期观察愈伤组织的分化情况，30天后统计不定芽的分化率;

（5）壮苗培养：将步骤（4）得到的高度为0.1～0.5cm分化芽苗接种到壮苗培养中进行壮苗培养,接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～15小时，光照强度为3000～4000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至大部分试管苗高于3cm,一个月后统计高于3cm的不定芽数;

（6）生根培养：将步骤（5）过程获得的丛生芽切割成3.0～5.0cm带芽茎段并接种到生根培养基上进行诱导培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照13～15小时，光照强度为3000～5000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；

（7）炼苗移栽：将步骤（6）获得的高3.0～5.0cm的根系发达且叶片展开的健壮试管苗在培养室内半开瓶口放置1～3天，然后完全敞口炼苗5～10天，洗净在根系上附着的培养基,移栽到珍珠岩:园土:蛭石＝1:1:1的混合基质中，移栽前一天将基质浇透水,保持湿度90%以上，以塑料薄膜覆盖5～10天后揭去，30天后统计成活率。

2.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1～4mg/L6-BA+0.2～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

3.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为MS+0.1～1.0mg/LNAA+0.5～2mg/L 6-BA+0.01～0.5mg/L 2,4-D+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

4.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.5～1.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

5.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（5）所述的壮苗培养基为：MS+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

6.根据权利要求1所述的一种钝叶瓦松组织培养再生体系的建立方法，其特征在于步骤（6）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。