[发明专利]基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

汞及其化合物对人体健康存在多种伤害，若存在于天然水体中，则会对大范围的人群造成威胁。它能够在生物体内积累，通过食物链转移到人体内。人体内累积的微量汞无法通过自身代谢进行排泄，将直接导致心脏、肝甲状腺疾病，引起神经系统紊乱，慢性汞中毒，甚至引发恶性肿瘤的形成。

溶解态的Hg²⁺往往具有较高的化学活性，是排入天然水体中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有较高的水溶性，也是各种汞形态转化的枢纽。因此，汞离子的分析测定是人们十分关注的课题。目前，常用的汞化合物检测方法包括分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。

因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中汞离子的残留。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器。

本发明还提供了基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了3条DNA链，其序列分别是：

Probe1: 5’-GTTTGTTTGTTGGCCCGG-3’（SEQ ID NO：1）

HAP1: 5’-GTTTGTTTGTTGGCCCGTTCAAACAAACTTCTTTCTTTC-3’（ SEQ ID NO：2）

HAP2: 5’-SH-GTTTGCCAACATACAAAC-MB-3’（ SEQ ID NO：3）

其中Probe1与HAP1中画横线部分的T之间可特异性结合汞离子，从而形成“T-Hg²⁺-T”。

HAP2的5’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将HAP2固定在电极表面；3’端修饰有亚甲基蓝，它可以在一定的电位下发生氧化还原反应，我们就是通过检测该氧化还原信号来达到定量的检测目标物的目的。

本发明中只用到了一种酶：核酸外切酶Ⅲ，只对DNA双链3’端的平末端和凹末端起作用，对凸末端和单链没有作用。

本发明中汞离子的检测是在电极上实现的，通过两步循环的方式来实现信号的减小，从而实现汞离子的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：在有目标物存在的情况下,HAP1与Probe1中T之间会由目标物连接形成“T-Hg²⁺-T”结构，从而将Probe1与HAP1固定到一起。此时在核酸外切酶Ⅲ的作用下，将链切割开，并释放游离态的目标物与和Probe1完全相同的Probe1’，从而实现第一次循环放大，即目标物诱导的Probe1循环放大。在第二步循环中，利用了第一步产生的Probe1’及剩余的Probe1，因为该链与修饰到电极上的已打开发夹结构的HAP2碱基互补配对，在核酸外切酶Ⅲ的再次切割下，HAP2上MB成为游离态，致使检测到的电化学信号越来越微弱。由于本发明在进行过程中可不断产生Probe1’,在核酸外切酶Ⅲ的作用下，从而继续新一轮的循环，即第二步循环减小。

在均相反应中，两步放大的反应条件均为37℃，反应时间是2h。

一种基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，在电极上依次修饰有HAP2层、HAP1和Probe1层；

所述的生物传感器， HAP2层的厚度大为15±2nm、HAP1和Probe1层的厚度为10±2nm。

所述的生物传感器， HAP1和Probe1层中HAP1（摩尔）、Probe1（摩尔）、核酸外切酶Ⅲ（活性）的摩尔与活性的比为1：1：250。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2层修饰到电极表面；

（3）将HAP1和Probe1层修饰到电极表面。

所述的制备方法，优选将HAP2层修饰到电极表面的操作步骤如下：将1.0μM的HAP2滴加10μL到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2h。