[发明专利]一种蛋白制品中的核酸去除方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白制品中的核酸去除方法。

背景技术

采用基因工程技术生产的蛋白药品需要严格控制残留的宿主核酸类物质(DNA)含量，特别是抗体类蛋白药物临床应用剂量大，因此核酸类物质含量需要控制在很低的限度内。

目前通用子交换层析法可以去除大量的核酸类物质，但处理后成品的核酸残留量往往大于1pg/mg蛋白，有时甚至高达数十皮克/毫克蛋白，难以满足抗体类药物的需要。

需要提供一种新的核酸去除方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的核酸去除方法以及该方法制备得到的蛋白制品。

本发明蛋白制品的核酸去除方法，它是采用膜层析方法去除核酸，具体步骤如下：

a、用平衡液平衡膜层析柱；

b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；

c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；

d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；

e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可。

步骤a中，所述膜层析柱的填料为Mustang Q膜层析填料。

步骤b中，调节pH以及电导率的方法是：采用超滤的方法，将待处理样品的缓冲体系交换为平衡液。

步骤a和步骤d中，所述平衡液是含有NaCl的柠檬酸盐缓冲液，其pH为6～8，电导率为7.8～25.5mS/cm，NaCl浓度为50～150mmol/L，柠檬酸盐浓度5～30mmol/L。优选地，所述柠檬酸盐是柠檬酸钠。

本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的蛋白制品。优选地，所述蛋白制品的核酸含量低于0.1pg/mg蛋白。优选地，所述蛋白制品是单克隆抗体。

本发明方法可以有效去除核酸，蛋白回收率高，处理方法简单，工艺稳定性好，采用本发明方法处理后的蛋白制品的核酸含量小于0.1pg/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明核酸去除方法

1、试验材料

抗体蛋白样品的获得：

步骤1、一种可表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞的制备：

制备表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞：采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体(ATCC产品)中的dhfr(二氢叶酸还原酶)表达单元克隆到pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司产品)中，构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBF01。

根据文献报道(US Patent,US6399061)，采用化学合成技术合成重组抗CD20单克隆抗体的轻链和重链基因片段；采用DNA重组技术将合成的基因片段分别克隆到pBF01载体中，分别构建可表达抗CD20单克隆抗体的轻链和重链多肽的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H。

采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H共转染Invitrogen公司的CHO-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛选高表达抗体的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤)逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞株CHO-CD20。

步骤2、细胞培养

采用批次流加培养，得到细胞培养液。

步骤3、细胞培养上清的分离

采用深层过滤的方法获得细胞培养上清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤步骤2中的细胞培养液，收集滤过液。

步骤4、Protein A亲和层析

层析填料：采用GE公司的MabselectSuRe层析填料(一种耐碱的Protein A填料)。

层析流速：50～300cm/h。

填料清洗：用清洗液0.1mol/L NaOH+1.0mol/L NaCl清洗层析柱。

平衡：用平衡液20mmol/L PB(磷酸缓冲液)+50mmol/L NaCl、pH7.2平衡层析柱。