[发明专利]一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法及其临床应用

权利要求书

1.一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞；体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力；体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过正常组织中PCR扩增或者化学合成BDNF基因片段，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人间充质干细胞，获得过表达BDNF的间充质干细胞。

3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织；优选地，来源于人自体骨髓。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述病毒表达系统为慢病毒系统、腺病毒系统、逆转录病毒系统；优选地，选择慢病毒表达系统。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达BDNF的间充质干细胞，体外与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124的表达，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达显著下降，使得胶质瘤干细胞增殖能力和成球生长能力明显地降低。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达BDNF的间充质干细胞，在动物体内杀瘤试验中促使了胶质瘤中microRNA-124的表达，使得其靶基因STAT3、Akt和RelA表达显著下降，炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌也明显降低，使得胶质瘤大小显著缩小并且转移明显得到抑制。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，BDNF基因片段通过正常组织中PCR扩增或者化学合成法获得，引入双酶切位点连接到病毒载体上，取对数生长期的293T细胞，以(2～2.5)×10⁶细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用Lipofectamine^TM2000转染进行病毒包装；转染分为2组：阳性组和对照组；48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5分钟后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染；将两组病毒上清分别感染人间充质干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为DMEM/F12完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BDNF目的基因病毒转染人间充质干细胞成功，获得过表达BDNF的间充质干细胞。