[发明专利]一种猪2型链球菌细胞壁蛋白抗体检测方法的建立及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及兽医微生物学及动物免疫学技术领域，具体涉及基于细胞壁蛋白SspA（Subtilisin-like serine protease, SspA，枯草菌素样丝氨酸蛋白酶）的重组大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21/pET28a-SspA，及利用该菌株表达的猪2型链球菌重组蛋白，建立ELISA检测方法，适于与猪2型链球菌感染抗体的检测。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重要致病菌。根据荚膜多糖分型，猪链球菌有 35 个血清型，即 1/2 型和 1-34 型。其中猪链球菌 2型是毒力最强、流行最广的血清型。猪2型链球菌主要引起猪的脑膜炎、支气管炎、心内膜炎、关节炎、脓肿等疾病, 并可导致断奶仔猪死亡。人感染链球菌后,会引起脑膜炎、心内膜炎、败血症和永久性失聪,严重时能引起人的死亡。自 1968 年荷兰首次报道人感染脑膜炎病例后，有 200 多人因感染猪链球菌死亡。我国自七十年代以来有二十多个省市已发生或流行，该病在我国广泛存在并严重流行，已成为当前严重危害养猪业发展的一种主要疾病，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且也给人类造成了严重危害。

目前对于猪2型链球菌的致病机制的研究，主要集中在其毒力因子。已鉴定的猪链球菌2 型主要毒力因子有荚膜多糖 ( CPS )、溶菌酶释放蛋白 ( MRP )、细胞外蛋白因子 ( EF ) 、溶血素 ( SLY ) 等 。如谷氨酸脱氢酶 ( GDH )、38 kDa 蛋白、分泌核酸酶 ( SsnA )、猪链球菌细胞壁蛋白 ( SspA )等, 以及一些其它的潜在的毒力因子也与猪链球菌的毒力相关。由于猪2型链球菌的致病机制尚不清楚，尚缺少有效的疫苗和敏感的诊断方法，猪链球菌病一直未能得到有效的控制。

为了有效地预防和控制猪链球菌2型病，在加强免疫预防的同时，使用特异、敏感、快速、便于操作的诊断方法，为有效预防和控制猪链球菌2型的发生提供有力的手段和重要的工具。目前，猪2型链球菌的预防控制仍然以灭活疫苗免疫为主，该灭活苗产生的抗体对猪链球菌感染起到很好的保护作用。猪链球菌血清学抗体的评价方法有如琼脂扩散试验及基于全菌、荚膜多糖为抗原的间接 ELISA, 华中农业大学研制了猪 2 型链球菌荚膜多糖抗体的免疫试剂盒，并申请并获得了专利 CN201210245250.2，可用于检测猪链球菌血清抗体，该方法对灭活疫苗和野毒感染产生的抗体均能检测，无法判断猪 2 型链球菌感染抗体或免疫抗体。

一般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白常被作为疫苗的候选靶标和血清型诊断试剂。SspA蛋白是通过体内诱导抗原技术鉴定到的，是一种细胞壁蛋白，在感染机体内大量表达，而与免疫血清不能发生反应，因而可能作为一个诊断标识。鉴于SspA蛋白这些特征，本发明采用克隆sspA基因重要的功能域片段，大量表达纯化出SspA蛋白，利用该蛋白研制出快速、准确、安全、廉价的鉴别猪2型链球菌免疫猪与野毒感染猪的诊断试剂盒，为猪2型链球菌的诊断及控制提供强有力的手段和工具。

发明内容

本发明的第一个目的在于获得一株能够分泌猪链球菌2型细胞壁蛋白的重组大肠杆菌，利用该重组大肠杆菌获得重组蛋白，利用该重组抗原蛋白制备猪2型链球菌血清学抗体检测方法。

实现本发明目的的技术方案为，申请人通过制备，获得一株能够分泌猪链球菌2型免疫保护性抗原的重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET28a-SspA,该菌株已于2014年7月21日送交湖北省武汉市武汉大学内的保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为 CCTCC NO: M2014344。

所述的抗原枯草菌素样丝氨酸蛋白酶SspA由序列表SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因编码表达得到。

为使本发明技术方案公开完全，本发明重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-28a-SspA的构建过程如下：

（1）猪2型链球菌基因组DNA的提取

将本实验室保藏的猪2型链球菌接种于含有10% 灭活新生牛血清的 TSA 培养基上，挑取单个菌落接种于 TSB 液体培养基中，置于摇床150 r/min ，37℃ 震荡培养过夜。取 1.0 ml 菌液于1.5 ml 的离心管中，参照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取链球菌DNA。

（2）目的基因的扩增