[发明专利]利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法

说明书

技术领域 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合成MV5 序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物技术领域。

背景技术 甘蔗(Saccharum officinarum)是最重要的糖料作物，蔗糖占我国食糖总产的90％以上。甘蔗花叶病是甘蔗上发生最普遍、危害最严重的一类病毒病害，它主要破坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，造成产量降低5％-19％、节间变短、品质变劣和品种退化。该病病原复杂，可由多种病毒引起，主要为甘蔗花叶病毒 (Sugarcane Mosaic Virus,ScMV)和高粱花叶病毒(Sorghum Mosaic Virus,SrMV)，属马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，编码10个成熟蛋白，分别为P1、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。且该病的侵染病毒极易分化，不同地区的分离物或株系均存在差异。在1997年已报道至少存在7个株系，包括属于ScMV的株系ScMV-A,B,D,E和属于SrMV的株系SrMV-H,I,M，这些不同株系的病毒均可引起甘蔗花叶病的发生。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种转录后基因表达沉默机制，构建可转录为双链RNA(dsRNA)的植物表达载体转化植物，可实现植物目标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。而且，引发RNAi的片段并不需要完整的基因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是多个不同病毒的基因片段。为此，我们采用RNAi技术，将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和 SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，并从多序列比对结果中分别选出两条 100％同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一起，作为RNAi干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，以获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。

专利号为ZL20071009226.8的发明专利“利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法”，介绍了一种利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P₁基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P₁基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。

发明内容 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV5培育抗花叶病甘蔗品种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花叶病高抗的转基因甘蔗。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明的利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：

(1)MV5序列的人工合成：

从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV5序列，同时在正义链 5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：

GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAA ATATCAAGTT TAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGAC TCAGGAGAAT ACAGAGAGAC ACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGC GCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTA ATATCAGGTA CCATCGATAG