[发明专利]一种弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7及单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤细胞株1D7及单克隆抗体。

背景技术

V-H+-PPase是一种独特的质子泵,在多种动植物中都存在。它能够水解无机焦磷酸盐的磷酸酐键，并利用所释放的能量转运质子，产生跨膜的电化学梯度，发挥和质子泵ATP酶类似的作用。V-H+-Ppase能使储存的能量高效转化为H+和/或电转膜梯度，用于多种不同的细胞内转运过程。V-PPases最早被发现存在于植物和光合细菌中，近期研究表明锥虫、利什曼原虫、弓形虫、恶性疟原虫也存在这种酶。值得关注的是，在这些寄生虫的动物宿主中均不存在这种酶类，因此V-PPases作为寄生虫病潜在的药物靶点具有重要的研究价值。弓形虫的V-PPases主要分布于酸性钙体及质膜，根据结构和功能的不同可分为两种类型，VP1和VP2。TgVP1需要K+激活其生物学活性。当弓形虫入侵细胞时，TgVP1组成圈状结构分布于弓形虫外缘，并随着弓形虫的侵入在虫体内迁移。当弓形虫完成侵袭过程时，TgVP1重新回到弓形虫的顶端。TgVP1含有17个跨膜域，N端具有信号肽序列，可以指导TgVP1进入弓形虫的分泌途径，但具体作用机制尚不明确。有研究表明弓形虫焦磷酸酶活性可抑制弓形虫在细胞内的复制。因此，TgVP1有作为潜在的弓形虫病临床诊断和治疗靶标的可能，制备TgVP1的抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot及免疫荧光检测的抗弓形虫蛋白TgVP1的单克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的检测弓形虫蛋白TgVP1的抗体是用合成TgVP1抗原多肽作为抗原免疫BALB/c小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株1D7，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1阳性，轻链为κ型。所述抗弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7，于2014年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2014230。

本发明中弓形虫蛋白TgVP1的氨基酸序列为EPT25031.1，如SEQ ID NO：1所示。

本发明中弓形虫蛋白TgVP1的抗原多肽序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO:C2014230的杂交瘤细胞株1D7的制备方法是：TgVP1抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:10⁵的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合；用含20％小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用TgVP1抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗TgVP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为1D7。应用此株杂交瘤细胞以1×10⁶/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

与现有技术相比，本发明特色如下：

本发明以合成的TgVP1抗原多肽包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对纯化的弓形虫蛋白进行Western-blot证明该抗体可以识别TgVP1蛋白。

本发明将此纯化抗体用于进行弓形虫的免疫荧光染色证明其能识别天然的TgVP1蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究TgVP1功能奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。