[发明专利]多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒，其特征在于，其用于同时检测隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫，该试剂盒包括如下引物：

隐孢子虫的特异性引物：

Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ ID NO.1；

Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ ID NO.2；

贾第虫的特异性引物：

Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ ID NO.3；

Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ ID NO.4；

环孢子虫的特异性引物：

Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ ID NO.5；

Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ ID NO.6；

微孢子虫的特异性引物：

Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ ID NO.7；

Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ ID NO.8。

2.一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的多重PCR检测方法，其特征在于，具体步骤包括如下:

(1)隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的虫体DNA提取；

(2)引物设计与筛选；所述设计的引物序列为：

隐孢子虫的特异性引物：

Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ ID NO.1；

Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ ID NO.2；

贾第虫的特异性引物：

Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ ID NO.3；

Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ ID NO.4；

环孢子虫的特异性引物：

Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ ID NO.5；

Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ ID NO.6；

微孢子虫的特异性引物：

Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ ID NO.7；

Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ ID NO.8；

(3)质粒构建；

(4)建立多重PCR方法，对所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；

(5)按照步骤(4)的PCR反应条件进行PCR扩增特异性验证；

(6)按照步骤(4)的PCR反应条件进行PCR敏感性验证；

(7)按照建立的多重PCR方法对样本进行检测和可行性验证。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫进行PCR扩增，PCR产物回收连接到pMD19-T载体，第二天进行转化；以单菌落为模板进行PCR扩增，每个培养板各挑取5个菌落，每个样本接1个阳性箘落，37℃，过夜培养，提取质粒进行PCR鉴定，并将PCR结果正确的质粒送测序。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：退火温度根据引物合成后参考温度，选取57℃、60℃进行PCR，根据扩增效果确定退火温度，最后确定最佳的多重PCR模式。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，退火温度为60℃。