[发明专利]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用

说明书

本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)‑细胞色素P450还原酶及其应用。本发明首次揭示了人参来源的NADPH‑细胞色素P450还原酶，其具有良好的辅酶特性，可协助细胞色素P450发挥催化活性，促进底物达玛烯二醇生成原人参二醇。本发明还揭示了编码所述NADPH‑细胞色素P450还原酶的多核苷酸，表达所述NADPH细胞色素P450还原酶的表达载体及宿主细胞，以及生产原人参二醇的方法。应用人参来源的NADPH‑细胞色素P450还原酶，可显著提高原人参二醇的生产效率，进而提高人参皂苷生物合成产量。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶及其应用。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶(EC1.6.2.4CytochromeP450 Reductase，CPR)是细胞色素P450(CYP)催化体系中重要的组成部分。细胞色素P450催化的氧化还原反应中需要电子(还原力)的供应，NADPH-细胞色素P450还原酶可以通过从电子供体获得电子后传递给CYP，为CYP所催化的反应提供还原力。如果没有CPR的存在时，CYP对底物就没有催化活性。NADPH-细胞色素P450还原酶属于核黄素蛋白家族，是一种膜蛋白并具有与辅酶FMN，FAD和NADPH结合的保守结构域。

由于CPR的结构域进化上非常稳定，因此在研究细胞色素P450的催化活性时，如果没有对应物种的CPR，通常会使用来源于其他物种的CPR代替。但是，两个酶来源的物种亲缘关系较远，则催化效率会明显降低。例如在丹参酮合成的例子中，使用来源于拟南芥的CPR(ATR1)促进丹参合成中的P450酶CYP76AH1作用，丹参酮的前体铁锈醇(ferruginol)的产量为2.1mg/L，而使用丹参自身来源的CPR(smCPR1)与丹参合成中的P450酶CYP76AH1协同作用能显著提高铁锈醇的产量至10.5mg/L。相比于已经报道的数量庞大的CYP(1万多个)而言，目前仅有不到100个CPR被鉴定，多数CYP并未有与其相对应的CPR协同作用。因此从同一物种或者亲缘关系较近的物种中克隆CPR会给CYP提供更合适的CPR，使这些CYP能更有效的发挥作用。

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)中的主要活性物质人参皂苷的合成途径中需要两个CYP(CYP716A47和CYP716A53v2)的作用，CYP716A47可对达玛烯二醇(dammarenediol-II Dm)进行羟基化修饰合成原人参二醇(protopanaxadiol PPD)，而CYP716A53v2可对PPD进行羟基化修饰合成原人参三醇(protopanaxatriol PPT)，原人参二醇和原人参三醇是各种人参皂苷合成的前体，通过多种糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase)进行糖基化修饰后合成多种具有不同生物活性的人参皂苷。虽然目前这个两个CYP基因已经被克隆和鉴定，但是尚无人参中的NADPH-细胞色素P450还原酶被克隆。以往的研究中这两个CYP所需的CPR都是用来源于拟南芥的CPR(ATR1、ATR2-1)等来代替。虽然与拟南芥来源的CPR配合，这些人参来源的CYP也具有催化活性，但由于拟南芥与人参的亲缘关系较远，其催化活性还有待提高。因此，本领域有必要开发更为适用的NADPH-细胞色素P450还原酶。

发明内容

本发明的目的在于提供烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供分离的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24任一所示的多肽；或