[发明专利]用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法

权利要求书

1.一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法，其特征在于：所述用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计方法是通过以下步骤实现的：

a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物：将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm-PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；

b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物；

c、Arm-PCR反应体系的配制；

d、Arm-PCR反应条件的设定与运行；

e、Arm-PCR产物的毛细管电泳检测；

引物组包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，用于Arm-PCR的第一步扩增；5’端ROX标记的超级上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增；

利用Arm-PCR检测引物组进行Arm-PCR反应，包括如下步骤：以转基因大豆A5547-127和转基因大豆GTS 40-3-2NOS终止子的质粒为模板；PCR扩增反应：在PCR管中配制第一步反应体系：引物液2.5μl，反应液Mix 12.5μl，转基因大豆A5547-127和GTS 40-3-2NOS终止子质粒各2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置空白对照反应时，用双蒸水代替模板；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min，94℃30s，60℃90s，72℃60s，15个循环；94℃15s，70℃90s，6个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；第二步PCR反应体系为：超级引物液1μl，反应液Mix 12.5μl，第一步PCR反应产物1～2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，30个循环；60℃延伸30min，最后4℃保存；结果判断：通过毛细管电泳检测Arm-PCR扩增结果；

引物的核苷酸序列分别如下所示：

1)A5547-127正向外引物Fo：CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG；

A5547-127反向外引物Ro：CTCATGCAACCTAACAGATGG；

A5547-127正向内引物

Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGGTTGGTTGCTGAGGTTG；

A5547-127反向内引物

Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGCCTATAACAGCAACCACAG；

2)GTS 40-3-2NOS终止子正向外引物Fo：CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

GTS 40-3-2NOS终止子反向外引物Ro：CTAGTAACATAGATGACACCG；

GTS 40-3-2NOS终止子正向内引物

Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC；

GTS 40-3-2NOS终止子反向内引物

Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

3)超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；

超级下游引物Fs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。