[发明专利]用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，还涉及上述引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用。

技术背景

世界上流行的艾滋病大多数是由HIV-1引起的。HIV-1基因组包含gag、pol和env三个结构基因和tat、rev、nef、vpr、vif、vpu 6个调节基因，在5’末端和3’末端为长重复序列(LTR)。Pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶，这三个病毒主要蛋白酶用于蛋白前体的成熟、病毒基因组RNA的逆转录和病毒cDNA在宿主基因组DNA上的整合。

目前市场上已流通30余种抗HIV-1药物用于艾滋病的临床治疗。由于HIV-1的逆转录酶在复制过程中没有校正功能又复制迅速，从而使得HIV-1易于进化、遗传多样性广泛，为HIV-1的耐药突变迅速产生提供了先决条件。目前，对应于每种临床使用的HIV-1治疗药物都有其相应的耐药突变的产生。

地达诺新（DDI）和富马酸替诺福韦酯（TDF）是目前常用的两种HIV核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs )，但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。研究已经证明引起DDI和TDF耐药产生的主要耐药突变是pol结构基因的K65R，K70E和Q151M三种突变。

现阶段应用于检测HIV-1耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。由于该方法检测周期较长，费用昂贵，非封闭操作，难于避免交叉污染，并且由于DNA 直接测序存在的灵敏度较低，杂合突变等问题，使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等问题，因此直接测序方法很难适用于临床检测。

随着艾滋病治疗过程中耐药情况的日益加重，临床上迫切需要开发出能够快速、准确、操作简便和避免交叉污染的HIV-1耐药突变检测方法，用于满足临床用药和检测诊断方面的时效性及个体化医疗方面的要求。

发明内容

本发明的目标是为解决现有技术检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的荧光定量PCR检测试剂盒，还提供了一种检测试剂盒的使用方法。

技术方案：本发明提供了用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；

K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；

K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端；

Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQ1标记5’端和3’端。

本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物对和Taqman探针；

K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。

本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第70位突变位点K70E的ARMS引物和Taqman探针；

K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端。