[发明专利]一种mir-505双等位基因敲除的方法

权利要求书

1.一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：

(1)将pIRES-neo2载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法插入到pIRES-neo2载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo-Xho I载体的Nru I位点，得到neo-Xho I-Nru I载体；

(2)将pIRES-neo2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP-C1载体上切割下来的EGFP基因插入载体中，得到neo-EGFP载体；载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo-EGFP载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo-EGFP-Xho I载体的Nru I位点，得到neo-EGFP-XhoI-Nru I载体；

其中，

步骤(1)和(2)扩增得到3’同源臂的引物为：

EGFP-505-R-F：CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG；

EGFP-505-R–R：CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA；

步骤(1)扩增得到5’同源臂的引物为：

EGFP-505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAACGCTTGCGGATGTGATT；

EGFP-505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGATTGGTCCTTGGCTGGTGT；

步骤(2)扩增得到5’同源臂的引物为：505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAAAGAGGGTGAATGCATGGGA；

505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGACTGGAAGCTTGCACATGGTT；

步骤(1)和(2)中的3’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用HotstartTaq酶特异性扩增得到的858bp mir-505基因的3’同源臂；

步骤(1)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的1559bp mir-505基因的5’同源臂；

步骤(2)中的5’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增得到的444bp mir-505基因的5’同源臂；

(3)将CRISPR/Cas系统载体和neo-Xho I-Nru I载体共同转染哺乳动物细胞，将mir-505基因被外源neo基因替换，通过G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞；再一次将CRISPR/Cas系统载体和neo-EGFP-Xho I-Nru I载体共同转染mir-505单等位基因敲除细胞，将另一条mir-505基因被外源EGFP和neo基因替换，挑选得到表达绿色荧光蛋白的细胞即mir-505双等位基因敲除细胞；具体步骤如下：

实验前将HEK293A细胞以1.5×10⁵细胞/孔的密度铺于24孔板中，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数中期，细胞汇合度在70％～80％时进行转染；将neo-Xho I-Nru I载体和CRISPR系统载体共转染HEK293A细胞，转染后细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中孵育24小时；24小时后，将细胞消化下来，重新铺到6孔板中，待细胞贴壁后，加入700ug/ml浓度G418进行抗性筛选；大约每3天更换新鲜培养基和添加新的G418；加药筛选4周后存活的细胞则为mir-505单等位基因敲除细胞。

2.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的双酶切为EcoR V和BamH I双酶切。

3.根据权利要求1所述的一种mir-505双等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的EGFP基因插入载体采用T4连接酶酶连的方法插入。