[发明专利]一种重组稀有鮈鲫雌激素受体双杂交酵母gERβ1-GRIP1及其应用

权利要求书

1.一种双杂交酵母，包括将含有稀有鮈鲫雌激素受体β1的配体结合域与DNA结合结构域的融合蛋白的编码基因和含有雌激素受体共激活因子与转录激活结构域的融合蛋白的编码基因导入基因型为MATα,ura 3-5,ade 2-101trp 1-901,leu2-3,112,gal4△,met-,gal80△,URA::GAL1UAS-GAL1TATA-Luc的荧光酵母中得到双杂交酵母。

2.根据权利要求1所述的双杂交酵母，其特征在于：所述含有稀有鮈鲫雌激素受体β1的配体结合域与DNA结合结构域的融合蛋白的编码基因是通过pGBKT7-gERβ1酵母表达质粒导入的；

所述pGBKT7-gERβ1的构建方法如下：用SEQ ID No.1替换pGBKT7的EcoR I和BamH I识别位点间序列，pGBKT7的其余序列保持不变，得到的重组载体即为pGBKT7-gERβ1；

所述含有雌激素受体共激活因子与转录激活结构域的融合蛋白的编码基因是通过pGAD424-GRIP1酵母表达质粒导入的。

3.一种双杂交酵母，包括将pGAD424-GRIP1酵母表达质粒和pGBKT7-gER β1酵母表达质粒导入基因型为MATα,ura 3-5,ade 2-101trp 1-901,leu 2-3,112,gal4△,met-,gal80△,URA::GAL1UAS-GAL1TATA-Luc的荧光酵母中得到双杂交酵母；

所述pGBKT7-gERβ1的构建方法如下：用SEQ ID No.1替换pGBKT7的EcoR I和BamH I识别位点间序列，pGBKT7的其余序列保持不变，即得。

4.一种定性或定量检测样品中具有雌激素受体结合效应的化合物的方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求1-3中任一所述的双杂交酵母，制备所述双杂交酵母处于对数生长期的双杂交酵母菌液；

(2)将雌激素化合物溶液与步骤(1)的双杂交酵母菌液混匀，制备成各暴露液，使得各暴露液中的所述双杂交酵母含量均相同，雌激素化合物含量均不同；

(3)将所述各暴露液暴露培养，得到各暴露后溶液；

(4)在所述各暴露后溶液中加入发光底物，得到各酶反应液；

(5)测定所述各酶反应液的酶反应发光值，即为各暴露后溶液的酶反应发光值；

(6)以所述各暴露液的雌激素化合物含量为横坐标，所述各暴露后溶液的酶反应发光值为纵坐标，得到酶反应发光值的剂量-效应关系曲线1，所述酶反应发光值的剂量-效应关系曲线1为S型，具有第一个平台期、线性上升期和第二个平台期；

(7)根据公式1得到各暴露后溶液的发光效应比值：

y＝f_n/f₀    (公式1)

公式1中：y—发光效应比值；

f_n—所述各暴露后溶液的酶反应发光值；

f₀—所述各暴露后溶液的酶反应发光值的最大值；

(8)以所述各暴露液的雌激素化合物含量为横坐标，所述各暴露后溶液的发光效应比值为纵坐标，得到雌激素化合物的剂量-效应关系曲线2及对应的公式2：

y=A-D1+(x/C)B+D]]>    (公式2)

公式2中：y—发光效应比值；

x—各暴露液的雌激素化合物含量；

A—最大发光效应比值；

B—曲线2线性段的斜率；

C—半数效应浓度；

D—各暴露液的雌激素化合物含量的检测下限；

(9)按照公式1得到待测样品暴露后溶液的发光效应比值y，将y带入步骤(8)得到的公式2中得到x，根据x得到待测样品中的具有雌激素受体结合效应的化合物的浓度；

所述发光底物为荧光素酶的底物。