[发明专利]适于在玉米中表达的优化α‑半乳糖苷酶基因aga‑F75及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及适于在玉米中表达的优化α-半乳糖苷酶基因aga-F75及其应用。

背景技术

豆粕和其它豆类饼粕作为最主要的蛋白原料在动物饲料中广泛使用，主要是因为它们的蛋白含量较高，而且来源比较广。然而由于这些豆类饼粕中通常含有许多抗营养因子而限制了它们在饲料中应用的比例。其中胀气因子的大豆中低聚糖主要是α-半乳糖苷之类的寡聚糖。α-半乳糖苷是由一个蔗糖单位(果糖-葡萄糖)与多个半乳糖单位，以α-1,6-糖苷键连接而成的长短不同的一类物质，如棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等。单胃动物体内缺乏α-半乳糖苷酶而不能分解这些物质。当这些物质经过大肠消化时，会被发酵产生大量气体，导致动物出现胀气和腹泻等不良症状。

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶，是一种外切糖苷酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。除此外该酶还可以把α-D-半乳糖基残基转移到不同的羟基类衍生物上即转糖基反应。因此它能水解蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖，还能水解含有α-半乳糖苷键的杂多糖。α-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物、微生物中，现已筛选出不少产α-半乳糖苷酶活性高的微生物，并进行了广泛深入的研究，尤其在酶制剂的制备和食品工业的应用方面，已取得很大进展。

现在生产上通常需要添加α-半乳糖苷酶制剂来促进营养物质的消化并消除或减少饲料组成中α-半乳糖苷糖类对营养物质消化的副作用，从而改善动物的生产性能，降低饲料成本。已经利用微生物发酵进行饲α-半乳糖苷酶的产业化生产，并在饲料工业中广泛应用，但其具有发酵过程耗能高，生产门槛高和成本高等缺点。而利用转基因植物生产α-半乳糖苷酶能够很好的解决如上问题，因而是进一步的发展方向，基因工程研究领域的进展使利用植物表达α-半乳糖苷酶用于饲料工业成为可能。

利用转基因植物生产α-半乳糖苷酶,其优势在于：1)转基因植物尤其是转基因玉米作为主要饲料原料，可以直接饲喂，避免了目前酶制剂的发酵生产和添加过程；2)生产规模不受限制，成本比较低。农作物的生产、运输、加工和贮藏等各种基础设施及技术早已具备，转基因植物高水平表达生产重组蛋白可以通过大规模种植来完成；3)目前初步的研究发现，在植物，尤其是种子中表达的非淀粉多糖酶具有更好的贮存稳定性和抗逆性；4)安全性好，用微生物发酵生产酶制剂，细胞培养过程中污染极其普遍，但在植物表达系统中没有这种污染。

玉米作为我国最主要的能量饲料粮之一，被称为“饲料之王”，其用量占配合饲料成份的60-70％。玉米籽粒是动物饲料最主要的成分，与其他饲料作物相比，转基因玉米作为生物反应器这具有更好的经济效益和应用前景。随着畜牧业的发展和新技术的综合应用，玉米已成为最重要的粮食、饲料和经济兼用作物。所以，在此新形势下，加强优质、专用和资源高效饲用型玉米新品种的培育和推广具有十分重要的现实意义。

来源于Gibberella sp.F75的α-半乳糖苷酶具有较优良的酶学性质，它同时具有很好的蛋白酶抗性，利用该α-半乳糖苷酶可培育具有优良性质的转基因植物。多种α-半乳糖苷酶资源分离、微生物重组表达的研究已经被报道，但由于大多数酶的蛋白质分子量较大，酶特性不能满足要求等原因，目前还没有在植物中重组表达该酶的报道，因此，本发明通过基因改造，载体选择、组织特异性表达等方式成功进行了玉米中的表达。

发明内容

本发明的目的之一是将来源于Gibberella sp.F75的α-半乳糖苷酶基因aga-F75进行一系列优化获得能够在玉米中高效表达、稳定性好的α-半乳糖苷酶基因aga-F75m；

本发明的目的之二是提供在转基因植物中高效表达优良性质α-半乳糖苷酶的具体方法。利用重组技术将aga-F75m构建到植物表达载体上，利用高效的组织特异性启动子介导，利用转基因技术，整合到植物染色体上，通过选择培养基得到阳性植株。再通过PCR、Southern blot、Western blot及酶活检测等方法筛选高效表达优良性质的转基因植株。

为了提高α-半乳糖苷酶基因玉米中的表达效率和稳定性，在不改变α-半乳糖苷酶氨基酸序列的前提下，本发明将来源于Gibberella sp.F75的aga-F75基因(GenBank登录号FJ392036)进行密码子优化。经密码子优化后，各氨基酸对应的密码子与玉米最适密码子更加匹配，GC含量由优化前的51.29％提高到优化后的55.82％；密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)由优化前的0.71提高到优化后的0.82。