[发明专利]一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括以下组分：

1)ELISA板条：以猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5％M/V脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4℃保存；

2)洗涤液：含0.05％吐温-20的pH7.4磷酸盐缓冲液；

3)血清稀释液：5％M/V脱脂乳；

4)底物显色液：已加入H₂O₂的TMB溶液；

5)羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗；

6)终止液：2M H₂SO₄溶液；

7)TGEV阳性血清；

8)TGEV阴性血清。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白通过以下步骤制备：

1)以猪传染性胃肠炎病毒TGEV的RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号JX827607.1，扩增片段大小为816bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N，N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒；

2)将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后6h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定，取诱导表达后6h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。

3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的ELISA试剂盒具体操作步骤如下：

1)加入血清样品：

用血清稀释液5％M/V脱脂乳将待检血清做1:80稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立TGEV阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用30分钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200μL洗涤液充分清洗5次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；

2)加入羊抗猪酶标二抗：

每孔加入100μL羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，按步骤(1)中方法洗涤；

3)加入底物显色液：

每孔加入100μL已加入H₂O₂的TMB溶液，室温下避光作用10分钟；

4)终止反应：

每孔加入100μL 2M H₂SO₄终止液，终止显色反应；

5)用酶标仪测定OD值：

使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度OD值；

6)结果判定。

4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的结果判定具体为：间接ELISA检测时加入阳性血清、阴性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值；试验成立的条件是：阳性对照孔OD450值均应该≧1.0且<3.0，阴性对照孔OD450值均应该≦0.2；计算各份血清OD450与阳性对照孔OD450的比值KQ，当样品KQ值≥26.768时为阳性，＜26.768时为阴性。