[发明专利]用于鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测的引物及含有该引物的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5′端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计而成。

2.根据权利要求1所述的一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：

引物1:5’–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’；或

5’–CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’；或

5’–GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’；

引物2:5’–CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’；或

5’–TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’；或

5’–GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。

3.一种包含权利要求1或2所述引物的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物对、SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水。

4.根据权利要求3所述的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液：包含有SYBRGreenI、ROXReferenceDye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、Mg2+和RNA酶抑制剂。

5.根据权利要求3所述的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照包含有IBV基因组5′端非编码区保守序列的重组质粒。

6.一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1）阳性对照质粒的构建：

5′端非编码区序列的RT-PCR扩增：根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列设计引物，用于扩增其5′端非编码区片段；

将H120疫苗株接种于SPF鸡胚，后收获尿囊液；采用RNAisoPlus提取基因组RNA，反转录采用PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit，构建20μL的反应体系，以5R作为反转录引物进行反转录反应；

以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增，PCR反应采用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，构建50μL的反应体系；PCR产物经电泳检测后进行胶回收；

重组质粒的构建及鉴定：将上述胶回收的DNA片段用Taq酶进行加T处理后，连接到pMD18-T载体中，转化JM109基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，将获得的阳性克隆进行序列测定，筛选阳性对照质粒pMD5UTR；

2）标准曲线的建立和溶解曲线分析

提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至10⁰～10⁹拷贝/μL，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线；扩增反应体系为：SYBRGreenI、ROXReferenceDye、ExTaqHSDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等10μL，pMD5UTR质粒2μL，浓度为10μmol/L的引物1和引物2各0.4μL，dH₂O补足至20μL，扩增反应程序为：95℃30s，然后95℃5s，60℃20s进行40个循环，然后95℃30s，20℃/s，60℃30s，20℃/s，95℃30s，0.1℃/s进行溶解曲线分析。