[发明专利]一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法

权利要求书

1.一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因的引物，为WA：3’-gaatcgaattcatgcggccgaaagtctgt-5’，

WB：3’-cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5’；

其中，所述RhlAB基因含鼠李糖基转移酶自身启动子和结构基因RhlA与RhlB；

2)以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化；

3)将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900-AB；

4)将构建好的表达载体pAK1900-AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；

5)摇瓶发酵，取200μL铜绿假单胞菌工程菌接入处于200mL锥形瓶中的20mL种子培养基，于37℃、180r/min条件下摇瓶培养12h，然后以10％接种量(v/v)接入处于500mL锥形瓶中的200mL发酵培养基，温度为37℃、转速180r/min，发酵时间为7d；

6)采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。

2.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的染色体模板采用野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CCTCC NO：M2011287。

3.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的PCR反应扩增RhlAB基因的反应条件为：94℃预变性5min；

30个循环：94℃，0.5min；50℃，0.5min；68℃，1min；

最后在68℃条件下延伸10min。

4.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的受体菌采用保藏编号为CCTCC NO：M2011287的铜绿假单胞菌，将铜绿假单胞菌贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养，从37℃培养16-20h的平皿内挑取单菌落，接种于5毫升LB的30毫升灭菌试管中，于37℃下振荡培养，按1％(v/v)接入新鲜的LB液体培养基，取2mL接种于200mL LB培养基中，37℃下200rpm振荡培养2-2.5小时OD₆₀₀为0.3-0.5，将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置10min后，4℃，4000rpm，离心10min收集对数期细胞，弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积，即20mL，的无菌、预冷的终浓度为20mmol/L的CaCl₂和80mmol/L的MgCl₂溶液中，4℃，3,500rpm，离心10min；弃上清，再将菌体悬浮于2mL的预冷的0.1mol/L的无菌CaCl₂溶液中，为感受态细胞，分装于1.5mL的Eppendorf管中，200μL/支，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20％，于-80℃冰箱中冻存。

5.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的热激法转化采用每100μL感受态细胞中加入5-10μL连接液，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴1min，加入600-800μL LB培养基，于37℃摇床培养lh，以使细菌复苏，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。

6.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的硫酸-蒽酮法测定通过分别吸取稀释500倍的菌株发酵液1.0mL于干净试管中，冰水浴中加入4mL0.2％的硫酸-蒽酮溶液，混匀后置于100℃的沸水浴中15min，取出后自然冷却，以蒸馏水做空白对照，用酶标仪测定620nm的吸光值A，根据已测得的鼠李糖标准曲线，计算野生型铜绿假单胞菌和其工程菌株发酵液中鼠李糖脂含量，计算公式如下，其中，n＝发酵液稀释倍数：

单位mg/L。