[发明专利]产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种菌种和基因，尤其是产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因。

背景技术

β-甘露聚糖酶是水解以β-1,4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露寡糖、甘露多糖(甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖)的内切水解酶。β-甘露聚糖及其衍生物是半纤维素的第二大组分，是由β-1,4-甘露糖苷键连接的线状多糖，主链上通常还连接有α-1,6-半乳糖或葡萄糖，主要包括葡糖甘露(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)、葡糖醛酸甘露聚糖(glucuronomannan)等。在饲料工业中作为一种绿色饲料添加剂，用于消除β-甘露聚糖的抗营养作用。

β-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，植物、动物及微生物。在植物的种子、豆类植物发芽的种子及天南星科植物魔芋萌发的球茎中；在一些海洋软体动物的肠道分泌液中；在微生物如细菌、真菌、放线菌中等，均存在β-甘露聚糖酶。其中，微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源，如细菌中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌，以及放线菌中的链霉菌等。但是只有微生物β-甘露聚糖酶具有商业价值，微生物β-甘露聚糖酶是最重要工业用酶之一，其广泛应用于造纸行业中，近年来发现甘露聚糖酶也可以应用在食物和饲料、咖啡萃取、石油勘探和清洁剂行业中。尤其微生物β-甘露聚糖酶在饲料行业具有很大的市场。因为β-甘露聚糖酶是一种新型酶制剂，它能有效分解饲料中的β-甘露聚糖，生成甘露寡糖等物质。多项试验表明，在玉米—豆粕型日粮中添加β-甘露聚糖酶，可以提高动物的生产性能和健康水平，从而提高动物的生产水平，这在动物生产上具有重要意义。

微生物产生的β-甘露聚糖酶为多组分型,这些酶组分可能在分子量或等电点上有着微小的差别,但在水解甘露聚糖时活性却明显不同,存在一定的互补关系,这说明微生物β-甘露聚糖酶的诱导和分泌是一个复杂的代谢调节过程。不同来源的β-甘露聚糖酶,对不同来源的底物作用深度及其水解产物是不相同的。β-甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与α-半乳糖残基和葡萄糖残基在主链中 的位置、含量、酯酰化的程度有关。底物本身的物理状态也会影响酶对底物的作用，如结晶状态的甘露聚糖不易被降解。甘露聚糖经β-甘露聚糖酶作用后,通过HPLC或纸层析方法分析,主要产物是低聚糖(一般2～10个残基),产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关,但相对来说,产生单糖(甘露糖)很少或根本不产生。国内外对来源于不同菌种的β-甘露聚糖酶的生产有所报道,但多集中在碱性和中性β-甘露聚糖酶方面,而酸性β-甘露聚糖酶的微生物发酵生产国内很少有报道。而单胃动物饲料中使用的β-甘露聚糖酶要求是酸性的,因此,对酸性β-甘露聚糖酶的研究及其工业化推广将在饲料工业中具有较大的应用潜力。

利用分子生物学手段,可以开发产酶活性高、高效产酶的重组菌种。大部分的细菌来源的β-甘露聚糖酶属中性和酸性的。因此，细菌来源的β-甘露聚糖酶在适应宿主中的表达相关研究也成为了β-甘露聚糖酶研究的关键。因此开发高效产β-甘露聚糖酶在理论和工业应用上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法。

本发明另一个目的通过扩增，获得产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因，利用基因重组技术获得高效表达β-甘露聚糖酶的菌株，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过盐析、透析和层析分离制备电泳纯级别β-甘露聚糖酶。

本发明实现目的的技术方案是：

一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，步骤如下

(1)初筛：通过LB固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌纯化和活化37℃培养24h，将平板上长出的单菌落依次点接到筛选平板培养基上，37℃培养24h，将配好的刚果红倾倒于长出茵落的筛选平板上，10～15min后，倒去刚果红溶液，用物质的量浓度为l mol/L的NaCI溶液反复冲洗2-3次，加入NaCI溶液静置15min后倒掉，此时，产生β-甘露聚糖酶的茵落周围将会出现透明圈，将具有透明圈直径较大的的菌落进行斜面保存；

(2)斜面保存：将筛选出的产生β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株划线于斜面培养基上，在30℃恒温培养箱内培养24h，然后置于4℃冰箱保存；

(3)复筛：将初筛得到的菌株进行发酵，利用发酵产生的粗酶液进行耐酸耐蛋白酶实验；