[发明专利]微藻中甘油三酯含量的检测方法有效
申请号: | 201510101544.1 | 申请日: | 2013-11-20 |
公开(公告)号: | CN104730161B | 公开(公告)日: | 2016-10-26 |
发明(设计)人: | 梁国斌;刘维平;朱政滔 | 申请(专利权)人: | 江苏理工学院 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02;G01N30/06 |
代理公司: | 常州市江海阳光知识产权代理有限公司 32214 | 代理人: | 孙培英 |
地址: | 213001 江苏*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 微藻中 甘油 含量 检测 方法 | ||
本申请是申请号为201310585841.9,申请日为2013年11月20日,发明创造名称为“微藻油脂的提取方法和微藻中甘油三酯含量的检测方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种微藻细胞内油脂的提取方法和微藻细胞内所含的甘油三酯含量的检测方法。
背景技术
世界原油产量持续减少,预计到2018年将下降至75亿桶/年,仅相当于1950年原油产量。随着石油资源日渐枯竭、全球性能源短缺及环境污染等问题日益严重,开发绿色、清洁的生物燃料代替传统化石燃料,已成为国际研究热点。
生物柴油是指由植物油、动物脂肪以及微生物胞内油脂与短链醇经酯交换反应得到的有机脂肪酸酯类物质,作为可再生替代能源,环境友好性和可再生性使其具有很强的竞争力。在生物柴油的众多原料中,微藻具有光合作用效率高、含油量高、生长周期短、油脂面积产率高等特点,被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。微藻直接利用阳光、二氧化碳及氮、磷等简单营养物质在胞内合成大量油脂。大多数微藻胞内的油脂组成主要为甘油三酯(含量≥80%)和C14-C22的长链脂肪酸,其中脂肪酸以C16和C18系脂肪酸为主。
由于微藻细胞外具有坚韧的细胞壁,因而对微藻细胞内甘油三酯进行提取前首先应该对藻体进行前破壁处理。微藻细胞内甘油三酯的提取率与细胞壁是否完全破碎密切相关。常见破壁方法有研磨、酸热法、藻体自融法、蛋白质溶剂变性法、反复冻融法、超声波破碎等。其中超声波法适合于大多数微藻细胞,超声波对细胞破碎的效率与细胞种类、时间和浓度有关。
微藻细胞破碎后,对微藻细胞内油脂进行提取的方法也至关重要。目前,关于微藻胞内油脂的直接提取方法主要有物理压榨法、有机溶剂提取法、超临界萃取法等。其中,有机溶剂提取法是目前国内外广泛应用的一种方法。
例如中国专利文献CN 102816636 A(申请号 201210259778.5)公开了一种微藻油脂的提取方法,首先离心收集微藻细胞,经冻干得干藻粉;将干藻粉与酒精混合,经超声处理;将超声处理后的物料加入索氏提取器中,于沸水浴中提取3至4小时,然后经过滤分离、减压浓缩获得微藻油脂。
一般来说,所选用的有机溶剂应该力求在提取过程中获得高出油率,同时避免溶剂对人体的伤害,研究表明,单一溶剂很难将微藻胞内油脂提取出来。
关于混合溶剂提取方法,中国专利文献CN 102942991 A(申请号 201210511744.0)公开了一种微藻油脂提取方法,首先将微藻发酵液进行离心,收集分离之后的微藻细胞;将得到的微藻细胞用缓冲液冲洗,再制成待用藻液;将上述藻液进行2至3次反复冻融,在融化的同时加超声波场;对于冻融后得到的原液,用索氏提取装置采用萃取剂丙三醇∶乙醇∶石油醚=0.5∶6.5∶3进行提取;最后烘吹除去得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取剂。
此外,如何准确测定微藻细胞内油脂尤其是甘油三酯含量,是衡量提取方法是否有效的关键。选择快速、简便、高效、灵敏的测定方法具有重要意义。
目前最常用的测定方法是荧光测定法。例如中国专利文献CN 103063631 A(申请号 201210560247.X)公开了一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法,首先制作标准曲线:取微藻,离心后收集沉淀,用PBS缓冲液清洗干净后用PBS缓冲液稀释成藻液,作为标准藻液;取5份19.8mL标准藻液,配置不同浓度的三油精溶液;分别往三油精溶液中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟,测定各三油精溶液的荧光强度,以吸光度为纵坐标、三油精溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线并计算回归方程;然后将微藻油脂提取出来;取0.2mL制备的待测溶液加入19.8mL标准藻液中得到样品藻液,将0.2mL正己烷加入19.8mL标准藻液中得到空白样品,分别网样品藻液、空白样品中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟,分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度,样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度得到待测溶液的荧光强度,由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种油脂提取效率高的微藻油脂的提取方法以及一种更有效、准确检测微藻细胞内甘油三酯含量的方法。
实现本发明第一目的的技术方案是一种微藻油脂的提取方法,包括以下步骤:
①取微藻培养液离心分离后,去除上清液并将获取的微藻进行冷冻干燥,取冻干藻粉于试管中待提取。
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