[发明专利]一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子检测方法，特别涉及一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。

背景技术

环境中存在多种对人体有害的分子，快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。

17b-雌二醇被认为是作用最强烈、最具潜在影响的一类内分泌干扰物，广泛存在于河流、土壤、大气以及农产品中。它主要来源于杀虫剂、废气、食品添加剂、人畜排泄物及生活污水，即使在极低的浓度下也会对生物体产生明显的影响，其含量水平与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及男性生殖障碍具有显著相关性。传统的17b-雌二醇检测方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等，这些方法需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，需要经验丰富的操作人员，而且难以实现大批量样本的现场快速分析。另一种方法是以抗体来检测17b-雌二醇，但是抗体的制备过程繁琐，保存麻烦，而且要涉及多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。

G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成，在缓冲体系和hemin（氯高铁血红素）存在的情况下，可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP（辣根过氧化物酶）的催化活性，可催化氧化TMB（四甲基联苯胺）产生蓝色底物，使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测分子具有操作简单，方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低，需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术，但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤，而且酶的存储也比较麻烦，因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。

核酸适体（aptamer，源于拉丁语）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括核酸外切酶和如下核酸序列：

DNA1：待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸中，靠近核酸适体一端的为1*区，其余部分记为2*区；

DNA2：DNA2与DNA1的1*区和核酸适体的部分核酸连续互补配对，DNA2的另一端至少有4个碱基不与DNA1互补配对；

DNA3：具有茎环结构，其一端为1区，中间依次为2区和连接序列，另一端为G四聚体序列，G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构的茎上，DNA3的1区与DNA1的1*区完全互补配对，2区与2*区靠近1*区核酸至少部分连续互补配对。

作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，1*区至少具有6个碱基，2*区至少具有24个碱基。

作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，DNA2中至少有6个碱基与待测分子核酸适体连续互补配对。

作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，待测分子为17b-雌二醇，核酸序列如下：

DNA1：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-GCAGAT-GGGTTGGGATTACGATAGATAATA-3'（SEQ ID NO：1）；

DNA2：5'-ATCTGCGCTTCCGCGCTTATAATA-3'（SEQ ID NO：2）；

DNA3：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-ATTACGATAGTCCAATCACAACCTATCGTAATCCCAACCC-ATCTGC-3'（SEQ ID NO：3）；

DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl；

TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 μL 0.5%的TMB，20 μL 30%的H₂O₂，pH=5.0。

作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，核酸外切酶为核酸外切酶Ⅲ。