[发明专利]一种高纯度胰蛋白酶的制备方法

权利要求书

1.一种高纯度胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

(1)粗品溶解：将胰蛋白酶粗品用pH为2.0～4.0的水溶液溶解得到胰蛋白酶粗品溶解液；

(2)低pH孵放法灭活病毒：酸调节胰蛋白酶粗品溶解液至pH值为2.0～4.0，20～25℃放置1～3h；

(3)疏水层析纯化：将疏水层析填料装柱，用pH为7.0～8.0的50mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、1mol/L(NH₄)₂SO₄缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后取步骤(2)中灭活病毒的胰蛋白酶粗品溶解液上样，上样完毕，用上述平衡液冲柱，直至流穿峰A_280nm下至基线，然后用pH为7.0～8.0的50mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄溶液洗脱，收集洗脱峰；

(4)酶原活化：在步骤(3)中收集的洗脱峰中，加入CaCl₂溶液，使其终浓度为20～100mmol/L，调节pH值至7.3～7.6，加入胰蛋白酶，于0～10℃活化，得活化液；所述的胰蛋白酶与步骤(1)中的胰蛋白酶粗品的质量比为(0.5～1)：100；

(5)亲和层析纯化：将亲和层析填料装柱，用pH为7.3～7.6的50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后取活化液上样，上样完毕，用上述平衡液冲柱，直至流穿峰A_280nm下至基线，然后用经盐酸调节500mmol/L NaCl至pH为2.0～3.0的溶液洗脱，收集洗脱峰；

(6)洗脱液除盐：采用透析除盐或超滤除盐，再调节除盐完毕的洗脱液pH值至5.5～6.5，滤纸过滤，得滤液；

(7)膜过滤去除病毒；

(8)真空冷冻干燥，即得所述的高纯度胰蛋白酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶粗品是由提取过糜蛋白酶的牛胰滤液经盐析得到。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的pH为2.0～4.0的水溶液与所述的胰蛋白酶粗品的体积质量比为4～6ml/g；

步骤(1)中，所述的pH为2.0～4.0的水溶液为5mol/L的HCl溶液。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的酸为盐酸。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的盐酸为5mol/L HCl水溶液。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，在上样前还进行前处理，所述的前处理方法为：5mol/L的NaOH溶液调节灭活病毒的胰蛋白酶粗品溶解液pH值至7.0～8.0，0～10℃、3000～4000rpm的条件下离心15～20min，取上清液，即可；

步骤(3)中，所述的疏水层析填料为苯基-琼脂糖凝胶。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的调节pH值为采用5mol/L的NaOH溶液或5mol/L的HCl溶液进行调节。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的亲和层析填料为苯甲脒-琼脂糖凝胶；

步骤(5)中，上样前，活化液还进行前处理：0～10℃、3000～4000rpm的条件下离心15～20min，取上清液，经0.45μm囊式过滤器过滤，即可。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的透析除盐为将洗脱液分两步透析，①0～10℃，pH为2.0～4.0水溶液中透析除盐10h～24h；②0～10℃纯水中透析2h～6h；透析袋的截留分子量为10KDa；所述的超滤除盐中，超滤膜的截留分子量为10KDa，超滤浓缩后的体积为原洗脱液体积的1/8～1/5。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的滤纸过滤为采用三层滤纸过滤。

11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述膜过滤去除病毒为将滤液经德国赛多利斯集团的(0.45+0.2μm)-(0.2+0.1μm)-Virosart CPV病毒过滤器三联膜、2Bar压力下压滤。