[发明专利]转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法

权利要求书

1.一种转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用基因克隆方法从拟南芥中克隆获得转录因子基因AtMYC2，所述AtMYC2基因序列为SEQ ID:1的DNA序列；

(2)把AtMYC2基因可操作性地连于表达调控序列，形成含AtMYC2基因的植物表达载体；

(3)将含AtMYC2基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含AtMYC2基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；

(4)利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；

(5)定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中AtMYC2基因及丹参酮和丹酚酸生物合成相关基因的相对表达量；

(6)高效液相色谱法测定丹参转AtMYC2基因毛状根中丹参酮和丹酚酸含量，筛选丹参酮和丹酚酸含量显著提高的丹参转基因毛状根株系；

(7)DPPH清除自由基法测定丹参转AtMYC2基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性；

所述的丹参酮为二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I或丹参酮IIA；

所述的丹参酸为咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A或丹酚酸B。

2.根据权利要求1所述的一种转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法，其特征在于，步骤(3)所述的发根农杆菌选自菌株C58C1。

3.根据权利要求1所述的一种转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法，其特征在于，步骤(4)所述的PCR检测方法如下：

(4.1)分别设计发根位点基因BrolB、卡那霉素抗性基因kan的特异PCR引物；

(4.2)启动插入基因AtMYC2表达的组成型启动子为CaMV35S启动子；

(4.3)插入基因内部及NOS终止子内部设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增；

(4.4)紫外线下观察目的条带株系，出现目的条带则为阳性转基因丹参毛状根株系。

4.根据权利要求1所述的一种转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法，其特征在于，步骤(5)所述定量RT-PCR检测方法如下：

(5.1)对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，统一定量到0.5μg RNA反转录成25μL体系的cDNA；

(5.2)分别设计插入目的基因及看家基因Actin的引物，以相同量的cDNA为模板进行定量RT-PCR分析；

(5.3)分析基因AtMYC2及丹参酮和丹酚酸生物合成相关基因的相对表达量情况。

5.根据权利要求1所述的一种转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法，其特征在于，步骤(6)所述的高效液相色谱法如下：

(6.1)丹参酮：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65：35的乙腈和水；检测波长220nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量20μL；

(6.2)丹酚酸：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比30：70的乙腈和水，并用磷酸调节pH至2.03；检测波长281nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样量20μL。

6.根据权利要求1所述的一种转AtMYC2基因提高丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸含量的方法，其特征在于，步骤(7)中，丹参酮和丹酚酸的抗氧化活性的测定方法为：

(7.1)丹参转AtMYC2基因毛状根中提取丹参酮及丹酚酸；

(7.2)将步骤(7.1)所得样品稀释为浓度梯度：0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL的甲醇溶液各1mL；

(7.3)取步骤(7.2)所得溶液200μL，分别加入800μL 0.1mM的DPPH溶液，充分混匀；

(7.4)步骤(7.3)所得产物25℃下暗室放置30min；

(7.5)将步骤(7.4)产物在分光光度计下517nm处测吸收值；

其中，DPPH自由基清除率(％)＝[(A₀-A₁)/A₀×100]，

式中，A₀是对照样品(DPPH)的吸光度值；A₁是样品或标准品的吸光度值。